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Chapitre 1-Introduction générale

Table des matières

Notre laboratoire étudie le cancer comme une maladie de la différenciation, et c’est pourquoi nous sommes intéressés par les mécanismes de régulation transcriptionnelle d’un gène étroitement lié à la différenciation hépatique et à la carcinogenèse, soit celui de l’alpha-foetoprotéine (AFP). L’AFP est une protéine de la famille de l’albumine dont l’expression est retrouvée principalement dans le foie fœtal au cours du développement embryonnaire. Le gène AFP est réprimé lors de la différenciation terminale des hépatocytes pour être toutefois réactivé conséquemment à l’apparition d’hépatocarcinomes (HCC). L’utilisation de l’AFP comme marqueur des hépatoblastes (voir section 1.3.2) et aussi des hépatocarcinomes est très répandue, mais on ne connaît pas précisément les moyens par lesquels ces différents états cellulaires influent sur l’expression de l’AFP.

On observe une association marquée de l’expression de l’AFP avec les phénomènes de prolifération hépatocellulaire. Ainsi, cette protéine est exprimée presque exclusivement par des hépatocytes en prolifération, comme par exemple les hépatoblastes, les hépatocarcinomes et les hépatocytes en régénération, et son expression est associée à plusieurs maladies impliquant une régénération active du foie, comme les hépatites et la tyrosinémie par exemple (123). De plus, au cours du développement, l’AFP est réprimée prématurément et de façon réversible par l’action d’hormones glucocorticoïdes (GC) exogènes (16), qui activent la maturation et réduisent la prolifération des hépatocytes. Fait à noter, les hépatomes deviennent souvent résistants à ces effets, autant sur l’AFP que sur la prolifération cellulaire (15). Comme l’expression de l’AFP est régulée principalement de façon transcriptionnelle et que c’est la première fonction hépatique à être exprimée par le foie fœtal (dès la phase de spécification, voir section 1.3.2), il semble évident que ce gène soit activé par des facteurs de transcription précoces de la différenciation hépatique. Le caractère carcino-embryonnaire du gène AFP et la résistance des hépatomes aux effets répressifs des hormones glucocorticoïdes font donc de ce gène un excellent modèle d’étude afin d’identifier les différents mécanismes de différenciation qui sont déréglés dans les cancers hépatiques. Ceci constitue l’objectif immédiat de cette thèse.

Malgré l’hétérogénéité retrouvée dans les différents types de cancer en ce qui a trait à leur localisation, leurs symptômes et leur pronostic, les mécanismes cellulaires menant à la transformation tumorale opèrent selon des sentiers communs. Alors, comment se forment ces cancers?

Tout organisme pluricellulaire doit coordonner de façon précise chacune de ses cellules pour s’assurer de son bon fonctionnement global. Ainsi, chaque cellule doit obéir à certaines règles (provenant des signaux endocrines et paracrines de l’organisme) qui lui dictent le comportement à adopter afin d’assurer l’homéostasie des tissus et de l’organisme. À l’intérieur d’un tissu différencié, l’homéostasie est maintenue par plusieurs mécanismes fondamentaux. Tout d’abord un équilibre entre des signaux prolifératifs et anti-prolifératifs favorise normalement la quiescence des cellules. De plus, des signaux de survie et de mort cellulaire s’opposent à l’intérieur des tissus afin de permettre aux cellules saines de survivre dans cet environnement alors que les cellules anormales seront induites vers la voie de l’apoptose, évitant ainsi la propagation d’anomalies à l’intérieur des tissus. Les cellules sont également confinées à l’intérieur des tissus par des contraintes physiques introduites principalement par la présence des cellules avoisinantes, de la matrice extracellulaire et de vaisseaux sanguins à proximité pour l’apport en nutriment. Finalement, le raccourcissement des télomères à l’extrémité des chromosomes à chaque cycle cellulaire permet de limiter le potentiel réplicatif de chaque cellule à un nombre fini ce qui empêche une cellule d’accumuler et de transmettre trop de mutations génétiques.

Les cancers surviennent lorsqu’une ou plusieurs cellules échappent à ces contrôles et commencent à se comporter de façon déréglée, mettant en péril l’homéostasie de l’organisme (revue dans (88)). Cette dérégulation des sentiers cellulaires est occasionnée par des mutations survenant entre autres lors de la réplication cellulaire ou en présence d’agents mutagènes. Les cellules tumorales vont ainsi gagner un avantage sélectif sur les cellules normales en détournant certains sentiers utilisés au cours du développement normal, notamment ceux reliés à la prolifération, à la migration cellulaire et à la vascularisation, pour échapper à la quiescence et se propager. Les caractéristiques cellulaires des tumeurs les rapprochent d’ailleurs beaucoup de cellules d’un niveau de différenciation plus précoce car elles réexpriment souvent des fonctions fœtales ou immatures, ce qui permet de considérer le cancer comme une maladie de différenciation cellulaire (1).

On retrouve principalement deux façons de concevoir l’origine cellulaire du cancer. En premier lieu, les cancers pourraient prendre source de cellules matures qui se sont par la suite dédifférenciées, c’est-à-dire qu’elles ont perdu des traits cellulaires matures. Cette façon de voir les cancers a été jusqu’à maintenant la plus répandue; cependant, de plus en plus de groupes de recherche tendent maintenant à favoriser un autre mode de pensée, c’est-à-dire que les cancers pourraient provenir de cellules souches ayant perdu la capacité de se différencier, ce qui introduit le concept de cellules souches cancéreuses (revue dans (198)).

Comme pratiquement tous les tissus contiennent des cellules souches ou progénitrices, qui ont donc la capacité de croître et de se renouveler, il est facilement concevable que celles-ci puissent représenter une source non négligeable de cancers. Deux principaux indices nous amènent donc à considérer cette hypothèse. D’abord, les protocoles d’induction de tumeurs hépatiques (particulièrement des hépatocarcinomes) consistent souvent en l’administration d’un agent carcinogène inhibant la prolifération des hépatocytes couplé à un stimulus de régénération, ce qui active les cellules progénitrices présentes dans le foie, appelées aussi cellules ovales (6). Celles-ci vont alors se mettre à proliférer (et à exprimer l’AFP) ce qui fait de ces cellules en prolifération des cibles préférentielles pour l’accumulation de mutations. Ensuite, plus de la moitié des foyers dysplasiques de petites cellules dans le foie (les lésions précurseurs les plus précoces de la tumorigenèse hépatique) contiennent des cellules ovales et des cellules d’un phénotype intermédiaire entre celles-ci et les hépatocytes différenciés (129). Comme on n’y retrouve pas de cellules plus différenciées, il semble improbable que ces tumeurs proviennent des hépatocytes matures.

Un des problèmes concernant le traitement des patients atteints d’un cancer semble provenir de ces mêmes cellules souches qui vont souvent être résistantes au traitement anti-tumoral (revue dans (4) et (252). Suite à des traitements éradiquant des cellules tumorales partiellement différenciées, ces cellules souches tumorales vont donc pouvoir reformer intégralement la tumeur après les traitements pour mener à une rechute du patient. Donc l’application de thérapies différenciatrices permettrait entre autres d’épuiser le réservoir de cellules souches tumorales en leur faisant perdre leur caractère souche, ce qui permettrait de mieux traiter la tumeur et d’éliminer les risques de récidives. Si une cellule différenciée répond à un traitement anti-tumoral alors qu’une cellule souche y est résistante, pousser la cellule souche vers un stade de différenciation plus tardif pourrait permettre de traiter et d’éliminer ces cellules (5). Par ailleurs, réactiver ou forcer un programme de différenciation particulier pourrait permettre de reprogrammer une cellule tumorale ayant passé le stade souche et la mener ultimement vers l’arrêt de sa prolifération ou la quiescence.

Mais comment forcer des cellules tumorales à se différencier? Là est toute la question et notre approche exploite le modèle de la régulation transcriptionnelle du gène AFP pour y parvenir. Avant toute chose, pour bien situer et comprendre les processus régulant l’expression de l’AFP dans le contexte du développement hépatique, voici les bases de ce processus complexe.

Plusieurs étapes distinctes se succèdent de façon précise au cours de l’embryogenèse afin de former un foie mature capable d’assurer ses nombreuses fonctions de détoxification, de métabolisme énergétique, de production des protéines sériques ainsi que de synthèse des acides biliaires. Cette succession d’étapes permet d’établir un réseau transcriptionnel stable permettant de mettre en place le phénotype hépatique. Voici donc une brève description des différentes étapes et des facteurs qui y sont impliqués.

La différenciation hépatique débute au niveau de l’endoderme ventral du tube digestif qui se forme après la gastrulation (78, 265). C’est seulement à cet endroit et dans une fenêtre de temps précise que pourront être induits les gènes menant à la différenciation hépatique (259). Ce phénomène de compétence peut être expliqué par la présence préalable dans ces cellules de facteurs qui sont nécessaires à l’induction des gènes de différenciation. Dans le développement hépatique, deux régulateurs endodermiques très importants, soit HNF3β/FOXA2 et GATA6, remplissent cette fonction (24, 39).

HNF3β, un facteur de transcription de la famille Forkhead box, joue un rôle clé au cours de la gastrulation, dans la formation du nœud et l’établissement de la ligne primitive, précurseur de l’endoderme (71). Ces évènements sont cruciaux pour les étapes subséquentes de l’embryogenèse. L’expression de cette protéine est par la suite restreinte principalement aux cellules endodermiques qui donneront naissance au foie, aux reins, au pancréas et aux intestins (7). Les facteurs de la famille GATA sont pour leur part des facteurs de transcription à doigts de zinc qui sont de puissants inducteurs du phénotype endodermique (161, 190). GATA6 et GATA4 plus particulièrement se sont avérés essentiels pour l’induction de l’hépatogenèse (266), tout comme HNF3β (124). Ces deux familles de protéines semblent donc jouer un rôle primordial dans l’initiation et le maintien de la lignée endodermique et aussi dans la compétence à la différenciation hépatique (revue dans (259)).

L’étude de la région amplificatrice du gène de l’albumine, un gène hépatique exprimé au cours de la vie fœtale et chez l’adulte, a permis d’établir les fondements moléculaires de ce processus de compétence hépatocellulaire. Cette région amplificatrice possède des sites de liaison pour plusieurs protéines dont HNF3 et GATA. Lorsque des empreintes génomiques in vivo ont été réalisées sur cette région au cours du développement embryonnaire, seuls les sites de liaison pour HNF3 et GATA étaient occupés par ces facteurs au jour embryonnaire 7 (E7), avant même que ne soit transcrit le gène de l’albumine et ce, seulement dans les tissus endodermiques pré-hépatiques ayant le potentiel de l’induire (24, 83). De plus, il a été démontré que HNF3β et GATA4 lient leur site de liaison même lorsque celui-ci est disposé à l’intérieur de la structure compacte de la chromatine (33, 40), probablement, du moins dans HNF3, par la présence d’un domaine globulaire homologue à l’histone H5 (41). La liaison de ces deux facteurs à leur site altère la conformation chromatinienne ce qui libère les sites adjacents des contraintes chromatiniennes et permet la liaison subséquente des autres activateurs du locus albumine (39). Cela fait de HNF3 et GATA des facteurs pionniers dans l’ouverture de la chromatine et l’établissement de domaines de compétence transcriptionnelle, c’est-à-dire des domaines chromatiniens devenus accessibles à d’autres facteurs de transcription.

La spécification de la voie hépatique se produit au jour E8-9 (chez la souris), alors que l’endoderme ventral du tube digestif se retrouve à proximité du mésoderme cardiaque et juxtaposé au septum transversum, tel que schématisé à la figure 1-1. Ces deux tissus d’origine mésodermique vont sécréter des facteurs solubles qui vont agir de concert pour induire la différenciation de l’endoderme. Ainsi les cellules mésodermiques du septum transversum vont sécréter les facteurs BMP-2 et BMP-4 de la superfamille de TGF-β (199) alors que le mésoderme cardiaque va sécréter des facteurs de la famille FGF, principalement FGF1 et FGF2 (103). Ces derniers mènent à l’activation de sentiers de signalisation endodermiques qui vont permettre d’induire le phénotype hépatique tout en réprimant le programme de différenciation pancréatique (56). C’est ainsi que l’endoderme formera les hépatoblastes, cellules progénitrices qui vont mener à la formation des deux types cellulaires majeurs du foie soient les hépatocytes, l’unité métabolique du foie mature, et les cholangiocytes, les cellules des canaux biliaires (74, 209).

L’apparition des hépatoblastes est caractérisée entre autres par l’induction dans ces cellules de la transcription des gènes AFP et ALB qui sont parmi les marqueurs les plus précoces de ces cellules. De plus, cette étape est aussi marquée par l’induction des facteurs de transcription hépatique HNF4, HNF1α et des membres de la famille C/EBP (23, 251) dans les hépatoblastes. Ces facteurs transcriptionnels sont des régulateurs clés du phénotype hépatique puisqu’ils contribuent à l’établissement d’un réseau transcriptionnel qui s’avère primordial pour la suite du développement hépatique (118). La hiérarchie simplifiée des facteurs de transcription hépatiques opérant au cours du développement embryonnaire et menant à l’activation du gène AFP est schématisée dans la figure 1-2. Le facteur de transcription « fetoprotein transcription factor » (FTF) sera introduit plus en détail à la section 1.6.1.1.

Adapté de (259)

Après l’apparition des premières cellules hépatiques chez l’embryon, plusieurs étapes doivent être coordonnées afin de mener à la formation du foie (revue dans (265)). Ainsi les hépatoblastes doivent se mettre à proliférer et à migrer dans le septum transversum afin d’éventuellement générer une masse suffisante pour le bon fonctionnement du foie mature tout en constituant une niche primordiale pour supporter l’hématopoïèse (c’est à cette période que les cellules hématopoïétiques viennent coloniser le primordium hépatique, soit au jour E10 chez la souris) (258). De plus tous ces évènements doivent survenir tout en permettant la formation conjointe de la vasculature hépatique qui permettra de nourrir les cellules tout au long du développement jusque chez l’adulte. Tous ces phénomènes sont induits encore une fois par des interactions entre les hépatoblastes et les différents autres types cellulaires composant ce système.

Donc après que les hépatoblastes aient proliféré pour former une structure en forme de colonne suite aux signaux des mésodermes adjacents, il y a formation du bourgeon hépatique. Pour ce faire, il y a perte de la membrane basale et décollement des hépatoblastes qui migrent dans le septum transversum. Cette étape est régulée principalement par le facteur de transcription Prox1 qui diminue les interactions intercellulaires, en diminuant la quantité d’E-cadhérine dans les hépatoblastes (213), et en remodelant la matrice extracellulaire, par l’induction de protéases extracellulaires (172). L’importance, à cette étape, des interactions cellulaires avec la matrice extracellulaire, est soulignée par la dépendance de l’hépatogenèse aux signaux provenant de l’intégrine β1 (64). Il y a aussi présence dans le bourgeon hépatique de cellules endothéliales qui vont mener à la formation des vaisseaux sanguins. Ces cellules, tout comme les cellules hématopoïétiques, vont influencer positivement la prolifération et la maturation des hépatoblastes (146). Plusieurs facteurs sont par la suite nécessaires à la croissance et la survie des cellules du bourgeon hépatique. Parmi ceux-ci on retrouve encore une fois GATA6, essentiel à la prolifération des hépatoblastes (266), mais aussi les BMP et FGF toujours sécrétés par les cellules du septum transversum et du mésoderme cardiaque, respectivement (103, 199), et un autre facteur de survie sécrété par le septum transversum, soit HGF qui se fixe à son récepteur c-met à la surface des hépatoblastes (202).

Adapté de (44)

La croissance et l’expansion des hépatoblastes dépendent enfin d’une voie de signalisation très bien caractérisée et essentielle dans plusieurs processus développementaux, la voie WNT/β-caténine. Cette voie de signalisation est également nécessaire à la différenciation des hépatoblastes en cellules biliaires, qui s’initie à cette étape du développement (94, 154). Ce processus requiert l’inactivation du facteur de transcription HNF6 dont le rôle, en activant HNF1β, est de contrôler la morphogenèse biliaire (43).

La dernière étape du développement hépatique implique des changements cellulaires majeurs. Ainsi, aux environs du jour E17 (chez la souris) les hépatoblastes se différencient en hépatocytes qui vont former, par le biais des jonctions intercellulaires, un épithélium polarisé, le côté apical sécrétant les acides biliaires alors que le côté basal repose sur les cellules endothéliales. Cette architecture est très importante pour l’expression des gènes du foie mature puisque la suppression des jonctions cellulaires amène la perte de l’expression de plusieurs gènes reliés au phénotype hépatique adulte (42).

L’étape de différenciation terminale est encore une fois régulée par des interactions avec la matrice extracellulaire et par des facteurs sécrétés par les cellules hématopoïétiques, dont l’oncostatine M (OSM) qui, lorsqu’utilisée en combinaison avec les hormones glucocorticoïdes, permet d’induire la maturation de cellules hépatiques embryonnaires en culture (105-107). Cette maturation est caractérisée par la perte de la capacité de ces cellules hépatiques à supporter l’hématopoïèse, phénomène qui se produit aussi in vivo alors que les cellules hématopoïétiques migrent vers la moelle osseuse et la rate lors de la différenciation terminale du foie (106, 111).

La différenciation terminale des hépatocytes nécessite enfin l’action des « Facteurs de Transcription Enrichis au Foie » (FTEF), groupe de protéines représenté principalement par les membres de la famille HNF et de la famille C/EBP. Parmi ceux-ci, HNF4α et C/EBPα semblent y jouer les rôles les plus importants. HNF4 joue un rôle primordial dans l’établissement de l’architecture du foie mature en régulant l’expression de plusieurs gènes impliqués dans les contacts intercellulaires caractéristiques des épithéliums (176, 215, 248). De plus, HNF4 est au cœur du réseau transcriptionnel assurant le maintien du phénotype différencié des hépatocytes : il est notamment lié aux régions régulatrices d’environ 40% des gènes occupés par l’ARN polymérase II dans les hépatocytes (167) et il coopère avec tous les autres FTEF dans l’établissement du réseau de régulation croisée qui permet la stabilité du phénotype hépatique (118, 166). Finalement, HNF4 semble requis pour la régionalisation, observée dans le foie mature, de l’expression de gènes impliqués entre autres dans la production de l’urée, comme la glutamate synthétase (218). C/EBPα pour sa part est responsable, entre autres, de l’induction de plusieurs gènes métaboliques essentiels au fonctionnement du foie adulte, en plus d’être impliqué dans l’arrêt de la prolifération qui se produit lors de la différenciation terminale des hépatocytes (230, 246).

L’étape de différenciation terminale des hépatocytes mène à l’activation de la transcription de plusieurs autres gènes codant de nouveaux facteurs de transcription, des récepteurs nucléaires, des protéines sériques et c’est aussi à ce moment que survient la répression de la transcription du gène AFP par des mécanismes spécifiques qui font l’objet de la présente thèse.

La plupart des changements phénotypiques majeurs observés au cours du développement surviennent au niveau transcriptionnel, par la production différentielle de nouveaux ARNm. Ce type d’ARN est transcrit exclusivement par l’ARN polymérase II et les mécanismes complexes régulant son activité sont de mieux en mieux caractérisés.

L’ARN polymérase II (pol II) est un complexe protéique d’environ 500 kDa qui n’est capable en soi ni d’initier la transcription ni de reconnaître les différents promoteurs auxquels il doit se fixer pour produire les ARNm requis par la cellule. Pour ce faire il nécessite la présence de facteurs protéiques, au nombre de cinq et appelés Facteurs Généraux de Transcription (GTF) (revue dans (255)). L’assemblage de la pol II et des GTF mène à la formation du complexe de préinitiation de la transcription (PIC), qui est compétent pour initier la transcription d’un gène.

Parmi les GTF, le facteur TFIID contient plusieurs sous-unités dont la protéine TBP, la seule du complexe à se lier à l’ADN de façon spécifique. TFIID est donc le premier facteur à s’attacher au promoteur d’un gène, en reconnaissant la boîte TATA par la sous-unité TBP (178). La liaison de TFIID à la boîte TATA induit une courbure de l’ADN qui facilitera par la suite l’interaction entre la pol II et l’ADN (165). La présence de TFIID au promoteur d’un gène permet ensuite l’arrivée de TFIIB qui sert entre autres de pont pour l’interaction entre TFIID et l’ARN polymérase II et qui permettrait de positionner la polymérase au bon endroit pour initier la transcription (128). Ensuite l’ARN polymérase II fait son entrée avec le facteur TFIIF, qui interagit avec la polymérase et stabilise le complexe formé entre TFIID, TFIIB et la polymérase II. La formation de ce complexe permet ensuite l’entrée de TFIIE qui à son tour recrute et régule le dernier facteur, TFIIH. TFIIH est le seul GTF à posséder une activité enzymatique puisqu’il comporte deux sous-unités ADN hélicase ATP-dépendante et une sous-unité kinase cycline-dépendante (165). Ces activités enzymatiques, tout comme la présence de TFIIE et TFIIF, sont nécessaires pour l’ouverture de l’ADN et la formation de la bulle transcriptionnelle. Ces trois mêmes facteurs affecteront aussi les étapes subséquentes du processus transcriptionnel en favorisant la transition de l’ARN polymérase II vers l’étape d’élongation de la transcription (61).

Enfin, la plus grosse composante du PIC, l’ARN polymérase II, possède un domaine C-terminal (CTD) contenant des répétitions de l’heptapeptide Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Ces répétitions subissent plusieurs modifications post-traductionnelles régulant l’activité de la polymérase (revue dans (179)). Cette région est notamment phosphorylée par TFIIH pour conditionner l’initiation de la transcription. De plus, le recrutement d’autres facteurs importants pour les étapes subséquentes de la transcription est effectué via le CTD, soit : l’ajout de la coiffe en 5’, du poly-A en 3’ et l’épissage de l’ARNm.

La formation du PIC est donc une étape cruciale pour l’initiation de la transcription, mais ce processus général soulève une question primordiale : comment le complexe GTF/pol II est-il ciblé spécifiquement sur les gènes qui doivent être transcrits à un moment précis?

Afin de permettre une régulation spatio-temporelle fine de la transcription, tous les promoteurs de gènes transcrits par l’ARN polymérase II possèdent, en plus d’une boîte TATA (pour la majorité des gènes), des sites de liaison pour d’autres type de protéines : les facteurs de transcription. Ceux-ci se lient spécifiquement à l’ADN des régions régulatrices de leurs gènes cibles par leur domaine de liaison à l’ADN (DBD) et vont orchestrer le recrutement du PIC et permettre la modulation de l’expression de ces gènes. La spécificité des différents facteurs de transcription est assurée par des différences de séquences peptidiques et de conformations de leur DBD. La présence de régions génomiques régulatrices et modulaires d’un gène à l’autre, et de plusieurs facteurs de transcription différents à l’intérieur d’une même cellule, permet donc de cibler spécifiquement et différentiellement un grand éventail de gènes.

Les facteurs de transcription sont regroupés selon la conservation de certains domaines protéiques fonctionnels importants pour leur activité. Ainsi, il existe différentes familles de facteurs de transcription, dont la superfamille des récepteurs nucléaires qui représente une des plus grandes familles connues jusqu’à présent et à laquelle appartient FTF (voir section 1.6.1.1). Cette famille de récepteurs regroupe des membres qui sont très conservés à travers les espèces et dont certains sont retrouvés chez tous les organismes eucaryotes. Vu leurs nombreux rôles exercés au sein de la cellule, ces protéines ont fait l’objet de plusieurs études qui ont mené à une caractérisation très précise de celles-ci (revue dans (10)). Ainsi, tel qu’il est schématisé à la figure 1-3, les différents récepteurs nucléaires présentent une structure très conservée pour tous les membres de la famille. Parmi les domaines fonctionnels les plus conservés de cette famille, on retrouve le DBD et le domaine de liaison pour un ligand (LBD). Le DBD, situé au centre de la molécule, comprend deux structures en doigt de zinc ainsi que deux hélices α hautement conservées (69). La première hélice contient la boîte P, et permet la reconnaisance d’une séquence d’ADN précise dans le sillon majeur, soit l’hémisite de type AGGTCA, ce qui induit un changement de conformation de la boîte D dans le deuxième doigt de zinc du DBD, ce qui facilite la dimérisation du récepteur (12). L’importance de la boîte P pour diriger la liaison spécifique des récepteurs nucléaires est soulignée par des travaux de mutagenèse dans lesquels la mutation de cette région permet à un récepteur nucléaire de se lier à une nouvelle séquence d’ADN tout en ne permettant plus à cette protéine de se lier à sa séquence de reconnaissance normale (79).

Le LBD, situé quant à lui en C-terminal des récepteurs nucléaires, contient un domaine d’activation de la transcription (AF-2) qui permet le recrutement de cofacteurs essentiels à son activité transcriptionnelle. La liaison au LBD de ligands va mener à un changement de conformation de celui-ci et au recrutement de coactivateurs (revue dans (256)). Ce domaine est aussi en grande partie responsable de la dimérisation des récepteurs nucléaires lors de leur liaison à l’ADN (116). La partie N-terminale des récepteurs nucléaires contient le domaine le moins conservé de ces protéines, soit le premier domaine d’activation (AF-1) qui interagit avec des cofacteurs de façon indépendante de la présence du ligand (226).

Adapté de (193)

Comme une région régulatrice d’un gène peut posséder plusieurs sites de liaison différents, les interactions entre les protéines qui s’y lient peuvent mener à des réponses distinctes. Par exemple, deux facteurs peuvent se lier à une séquence d’ADN de façon coopérative ou même synergique, c’est-à-dire que le gène sera activé plus fortement par la présence des deux protéines alors qu’une protéine seule donnerait un niveau de transcription de base (31). Dans un deuxième cas, deux facteurs peuvent se lier à une séquence d’ADN de façon exclusive, c’est-à-dire que les deux protéines auront un effet antagoniste sur la transcription d’un même gène en entrant en compétition pour la liaison de la même séquence d’ADN (18, 219). De plus, certaines protéines ne possèdent pas de domaine de liaison à l’ADN (comme le récepteur nucléaire SHP par exemple) et la liaison de ces protéines à d’autres activateurs de la transcription inhibe l’activité transcriptionnelle de ceux-ci (205, 206).

Cette façon de voir la transcription demeure toutefois très simplifiée. Comme l’ADN est enroulé autour d’octamères d’histones pour former la structure dense et compacte qu’est la chromatine, les processus transcriptionnels doivent d’abord surmonter cet obstacle pour avoir accès à l’ADN. Plusieurs facteurs de transcription étant incapables de le surmonter par eux-mêmes (39), ils vont donc nécessiter la présence de cofacteurs particuliers qui vont être recrutés par les domaines d’activation de la transcription portés par les facteurs de transcription.

On retrouve encore une fois une grande diversité de familles de protéines agissant comme cofacteurs. Celles-ci vont effectuer plusieurs fonctions cruciales dans la régulation de la transcription soit : I) la modification des histones pour permettre à la structure chromatinienne de se relâcher, II) le déplacement des octamères d’histones pour exposer une région d’ADN particulière, III) l’échafaudage d’un complexe protéique permettant d’établir un pont entre les différents facteurs de transcription présents sur un gène, et IV) le recrutement de la machinerie transcriptionnelle (complexe GTF/pol II) pour permettre d’initier la transcription (voir figure 1-4) (revue dans (132)). Vu la grande importance de ces familles de protéines dans la régulation de la transcription, il n’est pas surprenant de constater qu’elles semblent impliquées directement dans la régulation de plusieurs processus physiologiques fondamentaux (revue dans (216)).

La régulation de l’accès à l’ADN étant primordiale dans les différents processus transcriptionnels, comment la cellule peut-elle changer le degré de compaction de la chromatine? La détermination de la structure du nucléosome, l’unité de base de la chromatine, a permis d’observer des projections disposées tout autour de cette structure dense et qui proviennent des parties N-terminales des histones (139). Ces queues d’histones contiennent plusieurs résidus pouvant être ciblés par la plupart des modifications post-traductionnelles connues à ce jour et dont certaines entraînent des changements majeurs du degré de compaction de la chromatine. Les effets les plus marquants sur la structure nucleosomale proviennent du niveau d’acétylation des queues N-terminales des histones. Une hyperacétylation de ces régions neutralise les charges positives présentes sur les histones et affaiblit leur interaction avec l’ADN, relâchant ainsi la structure de la chromatine (125, 235). Les protéines possédant une activité histone acétyl-transférase (HAT) remplissent donc généralement un rôle de coactivateurs puisqu’elles vont rendre l’ADN accessible à la machinerie transcriptionnelle (207). Parmi ces protéines HAT nous retrouvons entre autres les protéines CBP/p300, les protéines de la famille p160, et le complexe P/CAF qui coactivent un grand éventail de gènes (133). Dans le cas inverse, une hypoacétylation des queues N-terminales accentue l’interaction entre les histones et l’ADN ce qui a pour effet de former une chromatine très dense qui n’est pas accessible aux facteurs de transcription. Ainsi, les protéines possédant une activité histone désacétylase (HDAC) jouent généralement un rôle de corépresseurs (revue dans (53)).

Ces deux types d’activités enzymatiques semblent entrer en compétition à la grandeur du génome pour contrôler les différents processus cellulaires utilisant l’ADN comme substrat. Ainsi, l’équilibre entre les activités HAT et HDAC semble occuper un rôle déterminant dans le phénotype d’une cellule, notamment ses propriétés tumorales et différenciées, comme exemplifié par les effets des inhibiteurs de HDAC sur le degré de différenciation de plusieurs lignées cellulaires et aussi sur leur tumorigénicité (revue dans (58)).

Les autres modifications post-traductionnelles touchant les histones, notamment la phophorylation, la méthylation, la sumoylation et l’ubiquitination, ont un effet moins bien défini et on commence seulement à apprécier leur rôle dans la régulation transcriptionnelle. Quoique leur effet ne semble pas s’exercer au niveau de la structure de la chromatine comme c’est le cas pour l’acétylation/désacétylation des histones, ces marques laissées sur les histones semblent également très importantes pour la régulation transcriptionnelle et renforcent l’existence d’un « code des histones » (99). Ce code suppose qu’une modification précise sur un résidu spécifique d’une queue d’histone permet ou bloque une autre modification sur un résidu spécifique. Ce code est d’autant plus significatif que de nombreux cofacteurs possèdent des domaines protéiques capables de reconnaître ces marques. Ainsi il existe par exemple des domaines bromo et chromo qui reconnaissent respectivement les histones acétylées et les histones méthylées (52). Ces marques permettraient de stabiliser certains complexes protéiques sur les régions régulatrices d’un gène et ainsi favoriser l’action de ces complexes. Deux exemples de cette situation sont l’ancrage stable des corépresseurs SMRT et Sin3 sur la chromatine en présence d’histones H3 hypoacétylées et le recrutement de facteurs d’épissage sur les histones H3 triméthylées sur la lysine 4 (211, 241).

Outre les modifications d’histones, les cofacteurs possédant une activité enzymatique peuvent aussi cibler certains résidus présents sur les autres cofacteurs et aussi sur les facteurs de transcription engendrant ainsi une autre variété de réponses dépendamment des résidus ciblés (revue dans (242)).

Enfin, le domaine enzymatique d’un cofacteur n’est toutefois pas toujours requis pour moduler la transcription d’un gène. Certains cofacteurs vont plutôt servir de protéines d’échafaudage qui vont permettre l’assemblage d’autres cofacteurs dont l’activité enzymatique est essentielle à la transcription de ce gène (30). Le contexte présent sur une région régulatrice est donc très important pour ce qui est de la réponse d’un gène à un cofacteur donné.

L’autre classe majeure de cofacteurs est représentée par des complexes protéiques possédant une activité ATPase et qui ont la capacité de déplacer les nucléosomes pour rendre l’ADN accessible. Ces complexes sont regroupés sous trois principales familles soient : SWI/SNF, ISWI et Tip60 (revue dans (72)). Chaque sous-unité présente à l’intérieur de ces complexes joue un rôle spécifique. Certaines sous-unités se lient aux domaines activateurs des facteurs de transcription pour cibler le complexe à un gène précis alors que d’autres sous-unités sont responsables de l’activité catalytique du complexe ou de la régulation de cette activité.

Les remodeleurs dépendants de l’ATP agissent en transloquant l’ADN autour des nucléosomes ou tout simplement en désassemblant les nucléosomes présents (136, 137), laissant ainsi des fragments d’ADN nus (principalement au niveau des promoteurs des gènes). Le remaniement des nucléosomes peut agir de façon positive ou négative sur la transcription d’un gène, dépendamment du contexte génomique. Leur fonction consiste surtout à éliminer le nucléosome présent sur la boîte TATA d’un gène pour permettre la formation du PIC (263). Dans certains cas cependant, ces complexes vont causer le déplacement d’un nucléosome sur cette région pour ainsi réprimer la transcription du gène (155).

Une question qui n’a toujours pas été clairement résolue est la hiérarchie selon laquelle les cofacteurs interviennent dans l’ouverture de la chromatine d’un locus donné. Est-ce que l’activité ATP-dépendante des complexes de remodelage de la chromatine précède ou suit l’activité acétyl-transférase des coactivateurs pour activer la transcription d’un gène? Il semble qu’il y ait un ordre de recrutement défini de ces différents complexes, qui dépend du gène ciblé et encore une fois du contexte qui s’y crée (149). Notons à cet égard que l’activité de plusieurs de ces cofacteurs, voire tous, est modulée par les voies de signalisation cellulaire, ce qui ajoute une autre dimension de complexité dans la réponse transcriptionnelle des gènes dans différentes conditions (132, 134, 216).

À mi-chemin entre un cofacteur et un GTF se retrouve un complexe particulièrement intéressant dans la régulation transcriptionnelle, soit le complexe Mediator. Ce complexe a la particularité d’être requis pour la majorité sinon la totalité des processus transcriptionnels impliquant l’ARN polymérase II (225). Ses effets se retrouvent principalement à deux niveaux : premièrement il sert d’adaptateur entre les facteurs de transcription ou les cofacteurs et l’ARN polymérase II, et deuxièmement il augmente l’efficacité et le taux d’assemblage du PIC. Ainsi, Mediator joue un rôle très important dans la communication sur de grandes distances entre les régions amplificatrices et promotrices des gènes et sa présence au niveau du site d’initiation de la transcription permet de faciliter l’initiation de la transcription en stimulant l’activité CTD kinase de TFIIH (101). De plus, le recrutement du complexe Mediator augmente aussi le taux de réinitiation de la transcription par l’ARN polymérase II (2, 117).

Adapté de (140)

Le complexe Mediator est composé d’environ 30 sous-unités. Plusieurs sous-unités permettent son interaction avec des facteurs de transcription ou des cofacteurs, et ainsi son recrutement ciblé sur les gènes (223). De plus, ces différentes interactions avec les facteurs de transcription modulent sa conformation tridimensionnelle et par le fait même son action sur le gène auquel il est recruté (221, 222). Ces sous-unités sont organisées en trois principaux modules : un module de tête, un module de milieu et un module de queue. Le module de tête interagit avec le complexe formé par l’ARN polymérase II et TFIIF, ce qui permet de stabiliser le complexe Mediator au niveau du promoteur des gènes à activer (224). Les modules de milieu et de queue permettent l’interaction avec les facteurs de transcription et les cofacteurs. Ces trois modules sont présents invariablement à l’intérieur du complexe alors qu’un quatrième module, possédant une activité kinase, se retrouve seulement dans des complexes réprimant la transcription (3). La composition du complexe Mediator et son action spécifique diffèrent donc d’un gène à l’autre dépendamment, encore une fois, du contexte génomique et cellulaire.

Les hormones glucocorticoïdes (GC) sont des hormones stéroïdiennes synthétisées et sécrétées par le cortex surrénalien sous le contrôle de l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. Les hormones glucocorticoïdes exercent plusieurs rôles homéostatiques dans l’organisme. Entre autres, elles antagonisent la signalisation de l’insuline lors du jeûne, avec un effet notamment sur le gène de la PEPCK, impliqué dans la gluconéogenèse (revue dans (201)). Elles sont aussi impliquées dans l’homéostasie des protéines et des sucres dans le foie (169, 180) ainsi que dans le métabolisme des lipides (revue dans (240)). Un débalancement dans la synthèse ou la sécrétion de ces hormones résulte en un effet systémique important notamment au niveau du métabolisme énergétique et de la réponse au stress.

L’importance de la signalisation par les hormones glucocorticoïdes est soulignée par le phénotype létal chez le nouveau-né obtenu par l’inactivation ciblée de GR chez la souris (45, 46). En inactivant GR spécifiquement dans les hépatocytes, un autre groupe a pu démontrer un rôle pour ce récepteur dans le contrôle post-natal de la croissance corporelle des souris, via une interaction avec la protéine STAT5, activée en réponse à plusieurs cytokines (63). De plus, les hormones glucocorticoïdes ont un effet marqué sur la différenciation de certains types cellulaires en culture, dont les hépatocytes et les adipocytes. Ainsi, ces hormones sont utilisées en cultures primaires d’hépatocytes pour maintenir les fonctions différenciées de ces cellules alors qu’elles sont utilisées pour induire la différenciation de lignées pré-adipocytaires en adipocytes (9, 253, 254). Un rôle physiologique direct in vivo n’a toutefois pas encore été démontré de ce côté. Fait intéressant, l’ajout de dexaméthasone (Dex), une hormone glucocorticoïde synthétique, à une lignée cellulaire pancréatique induit sa transdifférenciation en hépatocytes (208). Enfin, les hormones GC sont aussi utilisées en clinique, à des concentrations supraphysiologiques, comme agents anti-inflammatoires (92).

En plus de mener à l’activation de plusieurs gènes, GR peut aussi réprimer spécifiquement la transcription d’autres gènes. Il existe trois principaux mécanismes documentés par lesquels GR va réprimer directement la transcription de ses gènes cibles : par liaison directe à l’ADN, par compétition avec un activateur pour la liaison à un site chevauchant ou par la fixation de GR à une autre protéine activatrice sans nécessiter sa liaison à l’ADN.

Un exemple de la répression par GR impliquant sa liaison directe à un GRE présent sur le gène cible, est celui de la glutathione S-transférase (GST). Sur ce gène, la liaison de GR mène au recrutement du corépresseur SMRT qui va se lier aux deux autres activateurs du gène, soit C/EBP et Nrf2, ce qui mène à la répression de leur activité et à l’arrêt de la transcription du gène GST (109). Un exemple de la répression de la transcription par GR impliquant la compétition entre GR et un activateur pour la liaison à l’ADN est celui du gène de l’ostéocalcine : GR lie l’ADN à un site chevauchant une boîte TATA de faible affinité, ce qui empêche la liaison des facteurs de transcription généraux et, par le fait même, la transcription du gène (150, 219).

Le troisième mode de répression par GR implique sa fixation sur les activateurs de gènes cibles par des interactions protéine-protéine. Quelques gènes sont déjà connus comme étant réprimées par la fixation de GR. Parmi celles-ci, ont retrouve les protéines AP-1, C/EBP, NF-kB, NGFI-B/Nur77 (91, 130, 142, 168, 257). Malgré les similarités de ce mécanisme de répression par GR, il diffère selon le contexte présent sur ces régions cibles. Ainsi, le gène de la POMC, activé par NGFI-B/Nur77, est réprimé par la fixation de GR qui recrute HDAC2 et Brg1 (19); le gène du IL-8, activé par NF-κB, est réprimé lorsque la fixation de GR bloque le recrutement de p-TEFb, un facteur essentiel à l’élongation par l’ARN polymérase II (138); et en ce qui concerne le gène de la collagénase-3, activé par AP-1, il est réprimé par la fixation de GR, qui recrute alors GRIP1, un cofacteur activant généralement la transcription, qui a ici un effet négatif (194).

Les souris exprimant un GR incapable de se lier à l’ADN (mutant de dimérisation) mais toujours capable d’interagir avec d’autres protéines se développent normalement et peuvent par la suite se reproduire (191). Malgré que le mutant de dimérisation de GR active encore certaines cibles directes (195), ces résultats soulignent l’importance des interactions entre GR et d’autres protéines dans l’activation comme dans la répression des gènes.

Adapté de (34) et (163)

Parmi les modèles de répression transcriptionnelle par GR, celui du gène AFP est établi depuis longtemps, sans que son mécanisme moléculaire ait encore été élucidé, ce à quoi s’adresse la présente thèse.

AFP est un gène faisant partie de la famille de l’albumine, exprimée par l’hépatocyte et dont l’organisation groupée sur un même chromosome est conservée entre les espèces, ce qui suggère un partage d’éléments régulateurs entre les différents membres de la famille et l’existence possible d’une région de contrôle de locus (LCR) (123). Malgré la présence d’éléments de régulation similaires entre les divers membres de la famille, chacun possède son propre patron d’expression au cours du développement, l’albumine (ALB) étant exprimée autant chez l’embryon que chez l’adulte, l’AFP seulement chez l’embryon et l’alpha-albumine (ALF) seulement après la naissance (17, 229) (figure 1-6A et B). Plusieurs laboratoires ont tenté d’expliquer la régulation particulière des membres de cette famille, notamment en ce qui a trait à l’AFP, étant donné son patron d’expression fœtale et sa réexpression dans l’hépatocarcinome.

Il a été établi par transgenèse que les 7 kb en amont du site d’initiation de la transcription de l’AFP suffisaient à conférer un patron d’expression comparable au gène endogène tout en conservant un haut niveau d’expression (113). Divers segments aux propriétés amplificatrices, promotrices ou atténuantes ont été identifiés à l’intérieur de cette région (figure 1-6C).

L’étude des sites hypersensibles à la DNase I, qui permet d’identifier les sites chromatiniens ayant une conformation plus relâchée, a localisé 3 principales régions susceptibles d’influencer la transcription du gène AFP (18, 237). Ces sites correspondent au promoteur et à deux segments de la région amplificatrice (EI et EII). Un troisième domaine (EIII), plus distal, a aussi été caractérisé in vitro par des expériences de transfection (76, 250). Lorsque couplés individuellement ou en groupe à un promoteur hétérologue, ces trois domaines ont présenté de l’activité dans un foie de souris adulte, concentrée autour de la région péricentrale seulement (186). Il semblerait donc que ces régions ne soient pas strictement responsables de la perte d’activité du gène AFP au cours du développement. De plus, les 1000 premières bases en amont du site d’initiation de la transcription de l’AFP, lorsque couplées à un amplificateur hétérologue, sont suffisantes pour conférer à un transgène la spécificité d’expression et la régulation développementale caractéristiques de l’AFP (28). Cependant, comme le promoteur opère in vivo avec ses propres amplificateurs, on ne peut pas exclure un rôle combiné entre les amplificateurs et le promoteur dans la régulation développementale de l’AFP.

La région EIII est caractérisée par la présence de sites de liaison pour les facteurs C/EBP et HNF3 (82, 151, 232). Cette région permettrait entre autres d’obtenir une expression plus constante d’un transgène lorsqu’il est introduit dans des souris transgéniques (151). La région EII, quant à elle, est peu caractérisée. On ne connaît que sa position au niveau de la région intergénique entre AFP et ALB ainsi que le fait qu’il soit dans une conformation ouverte (hypersensible à la DNase) dans les tissus exprimant l’AFP, sans toutefois être régulée de façon développementale (158, 237). Pour ce qui est de la région EI, elle est composée majoritairement de sites de liaison pour les protéines de la famille C/EBP. Cette région régulatrice est la plus active du domaine amplificateur du gène AFP (262) et elle est requise pour diriger une forte expression du gène dans les tissus permissifs, tout en étant spécifique aux stades précoces du développement hépatique (237). Finalement, la région P (promoteur) de l’AFP répond étroitement aux différents changements développementaux ainsi qu’aux hormones glucocorticoïdes et ainsi semble jouer un rôle clé dans la régulation de l’AFP (237). La situation est toutefois complexe en ce qui a trait aux sites de liaison qu’on retrouve dans la région P. Des études, réalisées in vitro pour la plupart, ont permis d’identifier une variété de sites de liaison à l’intérieur de ce court segment de 200 pb (47, 67, 85, 102, 261). Des études fonctionnelles subséquentes ont permis de cerner plus précisément les sites les plus probants pour la régulation du gène. Parmi ceux-ci se retrouvent des sites de liaison pour les protéines FTF, HNF1, NF1 et C/EBP.

Une protéine a été identifiée il y a quelques années par notre laboratoire à partir du promoteur AFP et son site de reconnaissance semble absent des autres membres de la famille albumine (73). Cette protéine, appelée FTF, s’est avérée essentielle pour le développement embryonnaire puisque l’inactivation ciblée de FTF chez la souris mène à la mort des embryons au jour E7.5, résultant d’un défaut de gastrulation (119, 173). Certaines évidences indiquent aussi un rôle pour FTF dans la différenciation de l’endoderme et l’établissement du phénotype hépatique (174). De plus FTF joue un rôle majeur dans le métabolisme hépatique adulte, principalement au niveau du métabolisme du cholestérol (54, 144) mais aussi en ce qui a trait au métabolisme énergétique (Malenfant et al, en préparation). FTF est un récepteur nucléaire orphelin se liant à la séquence TCAAGGTCA sous forme de monomère (73) et exprimé dans divers tissus d’origine endodermique comme le foie, le pancréas et les intestins, ainsi qu’au niveau des ovaires et des pré-adipocytes (pour une revue voir (65)). Malgré le statut dit « orphelin » de FTF, des phospholipides ont récemment été identifiés comme étant ses ligands chez l’humain sans toutefois que la portée physiologique de ce résultat ait encore été clairement établie (114, 170, 264).

Au niveau du promoteur de l’AFP, FTF serait un facteur « couplant », c’est-à-dire qu’il permettrait le couplage entre la région amplificatrice et le promoteur pour activer la transcription du gène (249). Sans la présence de FTF au promoteur AFP, la région amplificatrice n’a effectivement aucun effet sur la transcription du gène, qui devient essentiellement inactif (18, 73, 85).

Des sites de liaison pour les protéines de la famille C/EBP sont retrouvés principalement au niveau de la région amplificatrice AFP, particulièrement EI, mais deux sites ont aussi été identifiés in vitro au niveau du promoteur du gène, sans toutefois que leur importance in vivo n’ait été établie (18, 228, 260). Les membres de la famille C/EBP sont impliqués étroitement dans la différenciation et la prolifération de plusieurs tissus dont le foie, les adipocytes et les cellules hématopoïétiques (98, 122, 204). Les gènes C/EBP sont sans intron et peuvent produire des formes de différentes longueurs de la même protéine par l’usage de codons d’initiation alternatifs pour la traduction de l’ARNm (revue dans (187)). Il existe plusieurs membres de la famille C/EBP, chacun pouvant former des homodimères et des hétérodimères avec les autres membres de la famille par leur domaine de dimérisation qui consiste en un motif de fermeture éclair à leucines (ZIP). Les deux membres les plus documentés et aussi les plus abondants au niveau du foie sont C/EBPα et C/EBPβ.

Au cours du développement hépatique, on peut détecter l’expression de C/EBPα et C/EBPβ à partir du jour E9, soit lors de la spécification des hépatoblastes (251). Leur expression persiste jusqu’à la naissance où leur production s’intensifie considérablement (51). Les rôles attribués à ces deux protéines sont très variés et vont de la régulation du métabolisme énergétique à la réponse aux stimuli inflammatoires et à la régulation de la régénération hépatique (26, 48, 57, 212, 246). Malgré le rôle distinct de C/EBPα et C/EBPβ dans d’autres tissus, elles semblent jouer un rôle redondant dans les cellules hépatiques (36).

C/EBPβ et, dans une moins grande proportion, C/EBPα sont les cibles de plusieurs voies de signalisation cellulaire qui modulent leur activité transcriptionnelle, résultant ainsi en une transmission de l’information de la membrane au noyau. Ces voies de signalisation affectent les protéines C/EBP à l’aide de modifications post-traductionnelles qui ciblent des résidus spécifiques (25, 110, 131, 243). Cela résulte en des changements de conformation des C/EBP ou en des changements d’interaction avec d’autres protéines (89, 153, 243). Le ciblage des protéines C/EBP par les différentes voies de signalisation, en particulier les voies liées à la prolifération cellulaire, de même que le rôle qu’occupent ces protéines dans la différenciation cellulaire tendent aussi à supporter leur implication dans le développement de plusieurs types de tumeurs (revue dans (162)). Les protéines de la famille C/EBP semblent jouer un rôle central dans l’intégration d’un ensemble de signaux cellulaires.

Plusieurs hypothèses ont été avancées jusqu’à maintenant sur le mécanisme contrôlant l’expression développementale du gène AFP sans qu’une seule d’entre elles se confirme. Voici les trois principales hypothèses.

En premier lieu, une mutation retrouvée chez une famille présentant une persistance héréditaire de l’expression de l’AFP a été identifiée au promoteur dans les sites de liaison se chevauchant pour les protéines HNF1 et NF1 (148). Cette mutation change l’affinité de ce site en faveur de HNF1, ce qui a suggéré que la compétition entre les protéines HNF1 et NF1 pour leurs sites respectifs serait responsable de la répression développementale du gène AFP (18). Quoique très attrayant, ce modèle ne permet pas d’expliquer totalement la régulation développementale du gène de l’AFP. Premièrement, il n’y a pas de changement dans le rapport de la quantité totale de ces deux protéines au cours du développement hépatique qui pourrait appuyer une compétition entre les deux facteurs pour un même site de liaison (121). Deuxièmement, la quantité d’AFP produite dans les cas de persistance héréditaire est au moins mille fois moindre que lorsque la production de l’AFP est à son maximum, soit au cours de la vie foetale. Troisièmement, une mutation réalisée dans notre laboratoire, renforçant la mutation retrouvée dans la persistance héréditaire et éliminant le site NF1 en même temps qu’il introduit un site consensus pour HNF1, ne permet pas de persistance significative d’expression d’un transgène AFP/rapporteur dans le foie de souris adultes. Enfin, la provenance de l’AFP, dans le modèle de la persistance héréditaire, n’a pas été déterminée et pourrait possiblement provenir d’autres organes, notamment le rein qui exprime faiblement l’AFP au cours du développement et qui exprime aussi HNF1 (185).

Une seconde hypothèse concerne le segment LS qui a été décrit comme un site de liaison de faible affinité pour FTF (73). Le gène AFP serait réprimé au cours du développement hépatique alors que la protéine FTF perdrait la capacité à se lier à un site de faible affinité. Comme FTF stabiliserait la protéine HNF1 adjacente, la disparition de FTF entraînerait le remplacement de HNF1 par NF1 et la répression du gène. Cependant, aucune expérience jusqu’à maintenant n’a pu confirmer cette théorie.

La troisième hypothèse implique la présence d’une région atténuante entre le promoteur et la région EI (159, 239). Cette région comporte des sites de liaison chevauchants pour les protéines HNF3 et p53. Ainsi au cours de la vie fœtale, la protéine HNF3 occuperait ce site et permettrait l’activation de l’AFP alors qu’après la naissance, l’augmentation de la quantité de la protéine p53 viendrait concurrencer HNF3 ce qui empêcherait les régions amplificatrices d’activer l’AFP (49, 50, 126). Cependant, lorsqu’on enlève cette région, on obtient une persistance incomplète et très variable de l’expression du transgène d’une lignée de souris à l’autre et ce, seulement dans la zone péricentrale du foie (62). De plus cette région atténuante semble aussi posséder un effet négatif dans des lignées d’hépatomes qui expriment l’AFP (159, 239). Ces observations suggèrent donc fortement que cette région ne contrôle pas à elle seule la répression développementale de l’AFP.

L’injection de dexaméthasone, une hormone glucocorticoïde synthétique, à des rats nouveau-nés mène à l’arrêt prématuré et réversible de la transcription du gène AFP ainsi qu’à l’arrêt de la prolifération (16). Cette répression de l’AFP n’a toutefois pas de connotation physiologique, à prime abord, avec la répression développementale du gène puisque des rats surrénalectomisés répriment toujours l’AFP lors de la différentiation terminale des hépatocytes (15). Par ailleurs, les HCC deviennent souvent résistants à l’action anti-proliférative et AFP-suppressive des hormones GC par un mécanisme toujours inconnu. Certains éléments sont cependant bien établis sur la répression du gène de l’AFP par les hormones GC.

Premièrement, la répression du gène s’effectue au niveau transcriptionnel et résulte en la disparition rapide d’un site hypersensible à la DNase I qui correspond au promoteur AFP (la région P, figure 1-6C) (84, 236, 237). La cinétique de cette répression corrèle fortement avec la translocation de GR au noyau des cellules traitées et ne nécessite pas de nouvelle synthèse protéique (84, 237). Il nous est donc permis de croire que cette répression est un phénomène direct. Ensuite, la répression par les hormones GC requiert le DBD de GR, sans toutefois nécessiter sa liaison à l’ADN (121). Comme ce domaine est impliqué dans les interactions entre GR et d’autres protéines, il semble que la répression de l’AFP implique la liaison de GR à une protéine présente sur les régions régulatrices de l’AFP lorsque le gène est activement transcrit.

La cible de GR sur l’AFP et le mécanisme par lequel GR réprime celui-ci n’ont donc pas encore été identifiés. Fait à noter cependant, le phénomène de résistance aux hormones GC dans les hépatomes, du moins en ce qui a trait à la croissance cellulaire, semble impliquer C/EBPα, faisant de cette famille de protéines des candidats intéressants dans la régulation de l’AFP par GR (188, 189).

Le but premier concernant mon étude du gène AFP est d’identifier et de comprendre les mécanismes de différenciation qui sont dérégulés dans les hépatomes afin d’élaborer des traitements plus appropriés à ce type de tumeur. Pour ce faire j’ai voulu élucider les mécanismes de régulation transcriptionnelle gouvernant l’expression de l’AFP. Cela implique donc la résolution du contrôle développemental du gène AFP et en particulier le lien entre sa répression et l’arrêt de la prolifération cellulaire. De plus, le mécanisme de répression du gène AFP par les hormones GC ainsi que la résistance des hépatomes à cet effet sont aussi explorés.

Plusieurs questions demeurent en suspens concernant la régulation transcriptionnelle de l’AFP en ce que la majorité des travaux effectués jusqu’à présent a été réalisée in vitro ou avec des fragments de régions régulatrices isolés de leur contexte natif. Les travaux de cette thèse visent à améliorer la situation en conduisant une étude combinant des expériences réalisées in vivo et in vitro impliquant les différentes protéines régulant la transcription de l’AFP et les différents mécanismes de contrôle proposés au cours du développement hépatique et en réponse aux hormones GC.

Comme les études précédentes ont démontré une grande importance de la région distale (-100 à -200 pb) du promoteur AFP dans la régulation transcriptionnelle du locus, j’ai d’abord concentré mes efforts sur les protéines se liant à cette région afin d’en identifier les sites authentiquement utilisés in vivo et essentiels à son activité. Par la suite, j’ai voulu vérifier de quelle façon le locus AFP est réprimé dans un modèle cellulaire d’hépatome, en regardant particulièrement les interactions se produisant entre les régions amplificatrices et promotrices du gène et leur effet sur la transcription de l’AFP. Enfin, je me suis intéressé au phénomène de répression transcriptionnelle du gène AFP par les hormones GC en tentant d’en identifier le mécanisme d’action et la cible sur le locus AFP.

© Frédéric St-Pierre, 2009