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Table des matières
Chez Pseudomonas aeruginosa , un nombre important de facteurs de virulence ont été étudiés à ce jour. Pensons entre autres à toutes les enzymes hydrolytiques produites dans le milieu extracellulaire, les protéines d’attachement, les toxines, l’alginate etc., tous orchestré via le quorum sensing. Cependant, les gènes connus de la virulence ne forment qu’une mince proportion de 1,5 % de tous les cadres de lectures prédits par la séquence de PAO1 (Pseudomonas.com). L’hypothèse évidente que le nombre de gènes impliqués directement dans la virulence de la bactérie soit beaucoup plus élevé que prévu anime le désir d’en approfondir la connaissance. Dans ce projet, nous avons fait appel à la technologie de la STM. La STM est une technologie puissante permettant de cribler plusieurs mutants transpositionnels à la fois dans un seul animal, réduisant ainsi temps et efforts. La STM, utilisant l’hybridation différentielle, a servie maintes fois dans l’identification de facteurs de virulence chez d’autres organismes comme V. cholerae , S. aureus , S. pneumoniae , etc. En utilisant l’amplification par PCR du transposon et de l’étiquette unique, nous avons rendu la technologie beaucoup plus rapide et plus facile à interpréter (Lehoux and Levesque, 1999). De récentes études de recherche de facteurs de virulence à haut débit ont montrées la possibilité d’utiliser le PCR semi-aléatoire permettant d’amplifier directement la jonction transposon-ADN génomique pour un criblage encore plus efficace. De plus, ces nouvelles approches confèrent la possibilité de déterminé le pourcentage de couverture génomique avant le criblage in vivo (Bosse et al ., 2006). Un des critères cruciaux de la STM est l’utilisation d’un modèle animal fiable et établi. Nous avons décidé d’utiliser le modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat, car il mime bien les conditions du poumon FK. De plus, le modèle des billes d’agar nous procure un modèle d’étude à la fois stable et dynamique d’infection chronique permettant de comparer dans le temps le potentiel infectieux de différentes souches (indice de croissance et indice de compétition).
Plusieurs autres facteurs de la technologie de la STM vont influencer le résultat d’un criblage. La mutagénèse STM repose sur de multiples évènements de transposition et des scientifiques ont suggérés que les génomes pourraient posséder des sites de prédilection d’insertion du transposon (hot spots). Évidemment, plus il y a de mutants générés dans la banque, plus la couverture génomique sera importante. Par exemple, il aurait fallut générer une banque 10 fois plus importante en nombre de mutants que le nombre de cadres de lecture du génome pour avoir un pourcentage de ciblage de 99% (soit près de 60000 mutants!). Notre criblage ne compte que pour un peu plus d’un génome, soit 7968 mutants versus 5570 ORFs. La représentation graphique des différentes insertions transpositionnelles issues du criblage in vivo (voir figure 1, chapitre 3) montre une distribution assez uniforme ormis une importante section d’environ 1 Mb qui ne comporte que 4 insertions rapprochées. Évidemment, cette figure ne tient compte que des gènes essentiels à l’infection testés dans nos conditions expérimentales, il aurait été intéressant de connaître la distribution génomique de toute la banque de mutants. Les produits d’amplification issus d’une combinaison d’amorces, une spécifique au transposon et l’autre aléatoire, permettent d’effectuer des hybridations de type microarray donnant une vue d’ensemble des différents gènes visés par les transposons (Pobigaylo et al ., 2006). À l’inverse, des groupes de gènes, organisés vraisemblablement en opérons, ont été identifiés comme de nouveaux îlots de pathogénie; par exemple les gènes PA0073, PA0077, PA0082, PA0088, PA0090 et PA0098. La majorité des gènes, entre PA0070 et PA0091 ne possèdent pas de fonction connue, mais seulement des homologies significatives chez d’autres pathogènes comportant un arrangement génique similaire (données non montrées).
Notre étude s’appuie sur les différents facteurs de virulence connus de P. aeruginosa identifiés comme essentiels à l’établissement de l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Les gènes codant pour la biosynthèse des pilis (pilD , pilI et pilY1 ) sont cruciaux pour l’attachement cellulaire, la colonisation et l’infection chez tous les hôtes connus de Pseudomonas aeruginosa (Dorr et al ., 1998; Comolli et al ., 1999) et via la motilité de type « twitching » (Mattick, 2002). Les gènes responsables de l’hyperproduction de mucus extracellulaire de type alginate sont aussi connus pour leur implication en virulence et surtout dans l’établissement d’une infection chronique (Ramsey and Wozniak, 2005). Il est cependant surprenant de voir que des produits de gènes impliqués dans la mucoidie semblent essentiels à l’infection étant donné l’enrobage des cellules de P. aeruginosa dans l’agarose. Également connu comme facteur de virulence, la protéase alcaline (aprF ) persiste dans le poumon FK, mais est dispensable dans un modèle de kératite de souris (Suter, 1994; Pillar et al ., 2000). L’amido-peptidase PepA est nécessaire in vitro pour tuer les cellules épitéliales et est également une cause de pneumonie aigue chez la souris. Plusieurs des propriétés de PepA suggèrent qu’elle soit sécrétée via le système de sécrétion de type III (Hauser et al ., 1998). RhlB est une protéine impliquée dans la synthèse de rhamnolipides (biosurfactants) via le quorum sensing et essentielle aux interactions cellule-cellule est également un facteur de virulence très étudié (Davey et al ., 2003). Et finalement, estA et wbpX codent pour une lipase membranaire et une enzyme essentielle à la biosynthèse du LPS (Govan and Deretic, 1996; Daniels et al ., 2002).
D’autres contrôles internes à notre approche viennent valider la STM : l’identification de mutants auxotrophes présentés ici à cause de leur relation évidente au métabolisme central et intermédiaire (Tableau 1, chapitre 3). Effectivement, il a été démontré que la mutation purA (enzyme PurA impliquée dans la biosynthèse des purines) sert de contrôle négatif pour la croissance et le maintien de souches virulentes retrouvées dans le poumon du rat dans la technologie IVET (In vivo expression technology) (Angelichio and Camilli, 2002). Suite aux conjugaisons suicides des transposons, il aurait peut-être été préférable de sélectionner les transconjugants sur milieu minimal. Ceci aurait permis d’éliminer ces gènes d’auxotrophie essentiels in vivo mais non impliqué dans la virulence. Une étude chez V. cholerae a démontré qu’en co-inoculant un mutant auxotrophe bioB ::Tn et la biotine en supplément, on améliorait grandement la croissance dans le modèle de l’infection intestinale aigue chez la souris néonatale (Chiang and Mekalanos, 1998). Les données issues des différentes études d’auxotrophies démontrent les limites nutritionnelles des tissus sains pour les bactéries pathogènes.
Le criblage STM a également permis de faire ressortir de nombreux autres gènes essentiels à l’infection dans le modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat; présentés dans le tableau 2 du chapitre 3. À première vue, plusieurs caractéristiques des différents mutants atténués sont marquantes. En premier lieu, plus de la moitié des produits des gènes sont localisés au niveau membranaire ou dans l’espace périplasmique. Évidemment, les membranes cellulaires des bactéries à Gram-négatif recèlent d’innombrables protéines d’intérêt en virulence. Par exemple, les protéines des différents systèmes de sécrétion sont incluses dans les membranes internes et externes, des protéines d’interactions avec des récepteurs épithéliaux de l’hôte, des protéines senseurs, des systèmes à deux composantes etc. Bref, les membranes de P. aeruginosa sont le haut-lieu d’interactions majeures entre la bactérie et son environnement, confèrant ainsi une grande capacité d’adaptation et une grande versatilité nutritionnelle (Stover et al ., 2000). Une autre caractéristique importante ressortante de la banque de mutants STM est l’absence d’une bonne cohésion entre les différentes classes de gènes des projets génomes et de celles marquées par le criblage des mutants (voir figure 2, chapitre 3). Par exemple, la classe « facteurs de virulence sécrétés » est surreprésentée, supportant ainsi l’idée que la STM sert à identifier de nouveaux facteurs importants au maintient in vivo .
Les 214 mutants STM incapables de se maintenir dans le poumon du rat ont été analysés de façon systématique pour l’expression de différents facteurs de virulence connus de P. aeruginosa . Les tests ont été choisi en fonction de leur rapidité d’exécution et sont dans la quasi-totalité des cas, des tests répertoriés maintes fois dans la littérature. Bien que la liste des tests phénotypiques utilisés dans cette étude soit très exhaustive (8 tests en plus du modèle d’infection chez la drosophile) seulement 36 insertions génomiques (24%) ont été montré ayant un effet sur ces facteurs de virulence. Il est important de mentionner que plusieurs facteurs de virulence n’ont pas été testés (notamment l’hémagglutination, la relation avec le fer, la production de surfactants et le dosage des molécules du quorum-sensing). Le lien ainsi créé entre le phénotype d’un mutant et son incapacité à se maintenir in vivo en fait un mutant de choix pour des caractérisations futures. Une des caractéristiques intéressantes de cette liste (tableau 2, chapitre 3) est la redondance des phénotypes liés à la motilité. Effectivement, 20 mutants sur 36 sont affectés pour la motilité de type « swarming », 4 de type « twitching » et 2 de type « swimming ». La capacité à se déplacer de Pseudomonas aeruginosa lui confère des avantages importants comme l’aquisition plus efficace de nutriments, l’éloignement des substances toxiques, la dispersion dans l’environnement et la colonisation d’un hôte (Rashid and Kornberg, 2000). Appliquée à notre modèle d’infection pulmonaire chez le rat dans un groupe de 72 mutants différents, la capacité à se mouvoir devient cruciale, surtout parce que les cellules sont incluses dans des billes d’agarose. Effectivement, les souches incapables de motilité sont reconnues comme étant déficientes en virulence (Mattick et al ., 1996; Sonnleitner et al ., 2003). De plus, à l’inverse des facteurs de virulence sécrétés à l’intérieur du poumon, la complémentation en trans de la motilité bactérienne n’est pas possible. D’autres phénotypes intéressants ont été dénotés, tels que l’incapacité de la souche STM2895 à produire des exoprotéases (souche faisant l’objet d’une caractérisation moléculaire plus fine au chapitre 4) et la souche STM0151 étant incapable d’initier la formation d’un biofilm adéquat.
Le criblage de la banque STM nous a fourni plusieurs pistes permettant de poursuivre la caractérisation des mutants et ainsi confirmer l’atténuation de la virulence in vivo. Le chapitre 4 présente plusieurs expériences, dont les résultats ont mené à la caractérisation préliminaire du mutant P. aeruginosa STM2895 et à la proposition d’un modèle intégré de la régulation génomique. Les critères permettant d’arrêter un choix sur P. aeruginosa STM2895 sont sans contredits justifiables. En effet, la présence de 11 isolats STM2895 sur 214 (regroupés sur deux évènements transpositionels différents) renforçait l’hypothèse de l’atténuation in vivo de la souche ayant une insertion dans le gène PA2895 avant même la confirmation de l’atténuation de la virulence par l’indice de compétition. De plus, l’absence d’activité protéolytique dans le surnageant de culture de STM2895 suggérait plusieurs indices quant aux causes de cette atténuation. L’essai utilisé pour mettre en évidence le phénotype des protéases est une mesure semi-quantitative qui repose sur la dégradation de la β-caséine contenue dans le lait (voir matériel et méthodes, chapitre 4). La quasi-totalité des surnageants de culture des mutants testés ont démontré une zone d’hydrolyse égale ou légèrement inférieure à la souche sauvage PAO1. L’expérience ayant été réalisée selon les conditions de culture mises au point par Laux et collaborateurs (2002) c’est-à-dire 48 heures de culture en absence d’oxygénation, contournant les retards de croissance et permattant une production enzymatique maximale. L’absence totale d’une zone d’hydrolyse sur gélose au lait par les enzymes de la souche STM2895 a rapidement gagné notre intérêt pour la suite du projet. Effectivement, la dégradation de la caséine du lait est surtout due à l’action de la protéase LasB ou l’élastase B (Morihara and Homma, 1985). LasB est connue comme étant l’exoprotéase la plus abondante du surnageant chez P. aeruginosa (McIver et al. , 2004) et considérée comme un de ses principaux facteurs de virulence (Woods et al. , 1982).
Nous avons d’abord confirmé le résultat des géloses au lait par une technique quantitative à l’élastine Rouge-Congo (Rust et al ., 1994) spécifique à l’activité de l’élastase B. L’élastine Rouge-Congo repose sur une méthode colorimétrique où le substrat d’élastine (des ligaments bovins) est lié de façon covalente au colorant. Les données d’activité élastolytique obtenues avec les surnageants des cultures de 48 hrs sont présentées au tableau 3 du chapitre 4. Les résultats sont en accords avec ceux des géloses au lait, indiquant que le mutant STM2895 est déficient dans la production extra-cytoplasmique d’élastase B. Par contre, la faible reproductibilité statistique de l’essai d’élastine Rouge-Congo sur les cultures de 48 hrs, nous a poussé à démontrer le phénotype via l’induction de l’enzyme en courbe de croissance, où l’inoculum de départ et la densité bactérienne sont contrôlés. Les courbes de croissance réalisées pour le mutant STM2895 et pour une souche complémentée en trans par l’ORF de PA2895 démontre bien le chevauchement des courbes, n’indiquant aucun défaut de croissance, qui aurait pu être à l’origine du phénotype LasB (figure 4, chapitre 4). Tel que démontré auparavant par Brint et Ohman (1995), c’est à la fin de la phase logarithmique et au début de la phase stationnaire de croissance que l’élastase B est induite par le quorum-sensing (entre 0,8 et 1,0 de densité optique à 600nm) (figure 5, chapitre 4). On peut voir également que la complémentation en trans de l’activité LasB via plasmide recombinant pMON3401 (pUCP19 + PA2895) est partielle pour les analyses faites sur une courte période de temps de culture, tandis que la complémentation était totale avec les surnageants de 48 hrs. Ces observations semblent indiquer un problème au niveau de la régulation de la transcription pour le gène PA2895 exprimé en trans. Donc, les conditions de culture et la densité optique ont beaucoup d’influence sur l’activité élastolytique.
L’activité élastolytique de P. aeruginosa est principalement liée à l’expression de lasB , mais une deuxième élastase (LasA) est également produite conjointement via le quorum-sensing (Toder et al ., 1991). LasA fut démontrée importante pour l’activité élastolytique globale en générant les premières digestions et en permettant un meilleur accès à l’élastine (Peters and Galloway, 1990). Par contre, il est impossible de bien mesurer l’activité de LasA sur un substrat d’élastine. Nous avons donc utilisé un test quantitatif bien décrit dans la littérature reposant sur la dégradation du pont pentapeptidique du peptydoglycan de cellules de Staphylococcus aureus inactivées à la chaleur : l’essai de staphylolyse (Kessler et al ., 1993). C’est la diminution de la densité optique à 595nm de la suspension de cellules de staphylocoque tuées à la chaleur qui est mesurée, exprimant ainsi l’activité spécifique LasA. Les résultats obtenus en utilisant des surnageants de culture de 48 hrs pour l’analyse de la staphylolyse (présentés au tableau 2, chapitre 4) démontrent l’absence totale d’activité LasA par la souche STM2895. Les données obtenues pour la culture de la souche sauvage PAO1 en courbe de croissance montrent aussi l’induction de l’enzyme en fin de phase logarithmique (figure 6, chapitre 4). Ces courbes montrent aussi l’absence totale d’une activité de l’exoprotéase LasA dans le surnageant de STM2895 et d’une complémentation partielle du plasmide en trans pMON3401 comme c’est le cas avec l’élastine Congo-red. En résumé, l’activité des deux élastases LasA et LasB est nulle dans le surnageant de culture de P. aeruginosa STM2895 expliquant en partie le déficit de maintient in vivo de cette souche. D’autres protéases sont présentes dans le surnageant de culture de PAO1 ayant d’autres cibles que l’élastine, la sérine-protéase IV et la métalloprotéase alcaline. Ces deux exoprotéases ont été démontrées responsables de la dégradation de plusieurs molécules du complément, de cytokines pro-inflammatoires et de d’autres protéines du tissu conjonctif comme le fibrinogène et le plasminogène (Hong and Ghebrehiwet, 1992; Engel et al ., 1998). L’article publié par Caballero et collaborateurs (2001) fait état d’une méthode qualitative intéressante sur la mesure spécifique de l’activité de ces deux protéases dans les surnageants de culture : la dégradation de la poly-L-lysine. Le polypeptide composé essentiellement de lysine est incubé en présence du surnageant et ensuite séparé par chromatographie sur gel de silice (voir matériel et méthodes chapitre 4). La disparition des taches (spots) rapprochées du point de dépôt sur le chromatogramme correspondant aux polymères de haut poids moléculaire témoigne d’une activité hydrolytique. L’analyse du chromatogramme de dégradation de la poly-L-lysine réalisé avec le surnageant de 48 hrs de la souche STM2895 versus celui de PAO1 indique effectivement une activité diminuée pour STM2895 (figure 8, chapitre 4). L’absence de souches mutées contrôles pour la protéase IV et la protéase alcaline ne permettent pas d’attribuer cette faible activité à une enzyme spécifique. L’article de Caballero prévoit que l’ajout d’inhibiteurs spécifiques dans la réaction (le TLCK pour la protéase IV et l’EDTA pour la protéase alcaline) permet de vérifier l’activité spécifique à chacune de celle-ci. Cependant, dans le cas des surnageants de culture de STM2895 et de PAO1, l’utilisation de ces inhibiteurs n’a pas permis de conclure à l’implication spécifique d’une de ces enzymes. Ceci suggère donc que d’autres protéases (en plus des élastases A et B) sont touchées par la mutation de PA2895.
Lorsque nous avons comparé l’effet de la mutation de PA2895 sur la sécrétion d’exoprotéases avec une souche mutée dans les gènes lasB et/ou lasA , l’hypothèse de l’absence des enzymes dans le surnageant de STM2895 était la plus plausible. Effectivement, les étapes de clivage et de repliement de ces deux enzymes sont nombreuses et bien connues. D’abord synthétisées en pré-pro-enzyme, le polypeptide subira deux clivages successifs permettant la translocation de l’enzyme mature vers l’extérieur de la cellule liée à un propeptide stabilisant la protéase mais sans activité dans l’espace périplasmique (McIver et al ., 2004). Les élastases LasA et LasB utilisent le système de sécrétion de type II (SSTII) ou la voie de sécrétion générale. Le polypeptide nouvellement synthétisé sera pris en charge par les enzymes Sec via le prédomaine de la protéine (leader peptide) et ensuite via Xcp pour la translocation périplasmique et les étapes finales de repliement (Akrim et al ., 1993). De plus, les enzymes DsbA et DsbC (disulfide bond isomerase) présentes dans l’espace périplasmique sont essentielles à la sécrétion d’élastases, de lipases et de phospholipases actives et de toutes les enzymes extracellulaires passant par le SSTII (Urban et al ., 2001). La meilleure façon de vérifier le fonctionnement du SSTII dans la souche STM2895, était de montrer la présence ou l’absence des enzymes LasA et LasB dans le surnageant par immunodétection sur gel dénatrurant. La figure 7 du chapitre 4 nous montre les résultats des immunobuvardages sur les quelques souches clés. La présence de protéases LasA et LasB sous leur forme fonctionnelle (20 kDa pour LasA et 33 kDa pour LasB) dans le surnageant de STM2895 a permis d’écarter toutes les hypothèses liées aux problèmes de sécrétion et de clivage. Nous favorisons donc les hypothèses de mauvais repliement et d’absence des cofacteurs. L’activité optimale et la préparation efficace des deux élastases dépend de la présence d’ions divalents dans le milieu de culture (Olson and Ohman, 1992). Malheureusement, l’ajout de calcium, de fer, de magnésium, de zinc ou de manganèse dans le milieu de culture de STM2895 n’a pas influencé l’activité élastolytique contenu dans les surnageants. La seule hypothèse était celle d’un problème de potentiel d’oxydo-réduction (redox) du périplasme ne permettant pas le repliement correct des enzymes à action élastolytique. L’ajout de DTT ou de peroxyde d’hydrogène pendant l’incubation et après dans le but de faire varier le potentiel redox des cellules STM2895, est demeuré sans effet notable sur l’activité élastolytique. Par contre, la surproduction en trans d’une oxydoréductase putative, PA3498, à l’intérieur de la souche STM2895 a permis de rétablir partiellement le phénotype LasA et LasB. Ces données font l’objet d’analyses complètes dans le mémoire de maîtrise de Mme Karine Richard, étudiante du Dr Roger C Levesque.
Des analyses approfondies en bioinformatique n’ont pas permis de trouver une protéine homologue significative connue dans tous les différents projets génomes bactériens en cours ni aucun motif protéique conservé. Ces résultats supportent l’hypothèse que PA2895 serait un gène unique à P. aeruginosa et qu’aucun rôle biologique connu ne lui serait attribué, si ce n’est d’être ancré dans une membrane. La poursuite de la caractérisation du mutant STM2895, incapable de se maintenir in vivo et incapable de produire des exoprotéases, s’est dessinée autour de sa cotranscription évidente avec un gène conservé comportant un motif facteur sigma-70 de type ECF (extracytoplasmique function) et une identité de 31% avec FecI chez E.coli le régulateur du métabolisme du fer. Plusieurs tentatives infructueuses de démontrer la co-transcription de PA2895-PA2896 par analyses Northern chez la souche sauvage PAO1 nous ont poussé à conclure que le transcrit est très faiblement exprimé dans les conditions normales de culture. Les expérimentations réalisées dans le passé sur les facteurs sigma de type ECF (revue par Raivio and Silhavy, 2001) a permis de suggérer que PA2895 agirait comme facteur anti-sigma sur PA2896. Premièrement, les facteurs sigma sont co-transcrits avec leur facteur anti-sigma ancré dans la membrane cytoplasmique. L’organisation génomique et les analyses bioinformatiques de PA2895-PA2896 supportent ces caractéristiques (voir figure 1, chapitre 4). Deuxièmement, ce sont des sous-unités alternatives de la RNA polymérase impliquée dans la réponse à un stress extracellulaire (ECF, ExtraCellular Function). Dans le cas de PA2895-PA2896, le repliement d’exoprotéases qui dépendent du potentiel redox périplasmique. La découverte de plusieurs stress périplasmiques (température, salinité, pH, radicaux libres, etc.) étant à l’origine de la régulation alternative dépendante de facteurs sigma ECF inclut entre autres le défaut de repliement de protéines périplasmiques à action extracellulaire (Erickson and Gross, 1989; Raivio and Silhavy, 2001). L’espace périplasmique est connue pour être une région à fort potentiel oxidatif, contrairement au cytoplasme qui est réducteur et favorise la génération des ponts di-sulfures (Oliver, 1996). L’espace périplasmique des bactéries à Gram-négatif est exposé constamment aux variations environnementales étant donné la bonne perméabilité de la membrane externe. Les systèmes de types ECF existent pour transloquer un signal vers le cytoplasme pour amener la cellule à répondre aux changements environnementaux (Oliver, 1996). Dans le but d’élucider l’implication de PA2895 et PA2896 dans le contrôle du potentiel redox, nous avons emprunté la voie de la caractérisation du régulon transcriptionnel de l’opéron par l’approche des micropuces à ADN.
La micropuce P. aeruginosa souche PAO1 d’Affymetrix contient 5900 oligonucléotides (spots) au total, représentant 5769 sondes de PAO1, 5570 cadres de lecture ouverts annotés, les gènes codant pour les ARNr et ARNt et 199 régions intergéniques. De plus, 117 sondes représentent des gènes ne provenant pas de PAO1, des gènes de transposons, des gènes de résistances aux antibiotiques, alors que 14 sondes servent d’ADN contrôles provenant de Bacillus subtilis , Saccharomyces cerevisiae et Arabidopsis thaliana . Nous avons utilisé la micropuce d’Affymetrix pour étudier les changements dans l’expression globale des mutants STM2895 et PAO1 ΔPA2896 ::gm versus la souche sauvage PAO1. Les résultats présentés aux tableaux 4 et 5 (chapitre 4) proviennent d’une seule hybridation pour chaque souche comparées entre elles. Évidemment, il s’agit de données préliminaires, ces expériences devront être refaites pour en vérifier la reproductibilité. Pour les souches STM2895 et PAO1 Δ PA2896::gm, nous avons noté 128 gènes (64 plus et 64 moins) et 138 gènes (59 plus et 79 moins), 4 régions intergéniques et 12 régions codantes pour des ARNt lesquelles étaient différentiellement régulée par ≥ 5 fois (la description complète des différents changements apparaît au chapitre 4). Lorsque comparées entre elles, les données provenant des deux mutations sont très similaires. Effectivement, la cassette de résistance insérée dans le cadre de lecture partiellement délété de PA2896 provoque forcément un effet polaire sur PA2895, générant un mutant double. Donc, l’effet de l’inactivation simple de PA2895 ou des deux gènes cause sensiblement le même effet, comme c’est souvent le cas, tel que le suggère la revue sur les facteurs anti-sigma de Hughes et mathee (1998). Les données obtenues des résultats des transcriptomes ont permis de construire un modèle de régulation associant le phénotype d’exoprotéases et le métabolisme oxydatif du fer. Effectivement, les gènes aux tableaux 4 et 5 notés en caractères gras ont déjà été identifiés à la déficience en fer (Ochsner. et al . 2002; Palma. et al ., 2003). Il a été démontré que l’acquisition du fer est négativement contrôlée via le répresseur Fur qui bloque la transcription des gènes cibles lorsque la concentration d’ions Fe 2+ est suffisante (Neilands, 1990). Alors que le facteur sigma alternatif de type ECF, PvdS, est nécessaire à la transcription des gènes de biosynthèse de la pyoverdine (Vasil and Ochsner, 1999). Il semble y avoir une forte synergie d’expression entre les différents facteurs sigma ECF de P. aeruginosa car le fait de déléter PA2895-PA2896, apporte un effet négatif sur plusieurs autres opérons du même type (voir tableau 5, chapitre 4), engendrant des conséquences importantes sur PvdS par exemple. Les profils transcriptionnels des gènes liés au métabolisme du fer sont très semblables à ceux observés par Ochsner et collaborateurs (2002) où la biodisponibilité du fer a été réduite d’une part et pvdS muté d’autre part. Donc, les résultats des transcriptomes sur PA2895-PA2896 tendent à reproduire ceux d’une réponse en absence de fer, sensiblement causée par l’absence de PvdS. La souche STM2895 dénote également une forte induction des gènes du système de sécrétion de type III (SSTIII) contrôlant les exoenzymes Y et S ainsi que plusieurs gènes de virulence comme pour la biosynthèse des phénazine et des cyanures d’hydrogènes (composés toxiques pour les cellules eucaryotes). Plusieurs observations tendent à indiquer que le mutant STM2895 possède un métabolisme de l’oxygène altéré. Effectivement, la cyanogénèse (gènes hcn et phz ) chez P. aeruginosa et Pseudomonas fluorescens se produit lorsque la concentration en oxygène diminue (Castric, 1983). De plus, le processus de production de ces composés dépend de la conversion vers une forme active du régulateur transcriptionnel ANR (anaerobic regulator of arginine deiminase and nitrate reductase) en absence d’oxygène (Castric, 1994). Bien que ANR ne soit pas présent dans la liste des gènes altérés par la mutation PA2895-PA2896, un régulateur très apparenté à ANR, DNR (dissimilatory nitrate respiration regulator) appartenant à la superfamille CRP-FNR (cAMP receptor protein-fumarate and nitrate reductase regulator) est induit par la présence des nitrites (Rinaldo et al ., 2005). Les nitrites font partie des composés utilisés par P. aeruginosa comme accepteur final d’électrons. En absence des enzymes de dénitrification, Nar, Nir et Nor, le NO s’accumule dans la cellule (Arai et al ., 1999). Des études ont montré que la détoxification du NO en conditions anaérobiques est assurée par les flavohémoglobines (Arai et al ., 1995). Donc, il est logique de penser que cette situation s’applique au mutant STM2895 étant donné l’importante répression (-600 fois en moyenne) d’une flavohémoprotéine (PA2664) et des opérons nar , nir et nor (tableau 5, chapitre 4). En conclusion, les données soutiennent un modèle de régulation, certes imparfait, mais logique où la délétion d’un signal périplasmique venant de PA2895 inhibe la réponse de PvdS au manque de disponibilité du fer. Aisni, il y a activation du SSTIII, de facteurs de virulence (inactifs?) et du ferri-sidérophore alternatif (la pyocheline) dans le but de surpasser ce problème. A l’intérieur de la cellule, la détoxification du NO et des radicaux libres issu de la respiration oxygénique et anoxygénique est hautement réprimée, créant un environnement périplasmique inopportun au repliement correct des exoprotéases.
© Éric Potvin, 2007
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| Chapitre 4 Génomique fonctionnelle d’un facteur sigma essentiel in vivo régulant les protéases extracytoplasmiques de Pseudomonas aeruginosa |  | Conclusion |