| Collection Mémoires et thèses électroniques | |
| AccueilÀ proposNous joindre |
| Chapitre 1 | ||
|---|---|---|
 |  | |
Table des matières
Le chapitre 1 constitue d’abord et avant tout une introduction générale à la biologie de Pseudomonas aeruginosa . Il a été écrit selon une approche logique visant à bien faire ressortir les différentes relations qui existent entre l’hôte et le pathogène lors d’une infection pulmonaire chronique par exemple. Du même coup, le chapitre 1 se complète sur une brève mise en situation du projet et de toute la rationnelle qui s’y rattache.
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ) est un bacille à Gram-négatif, aérobie strict, non sporulant de forme droite ou légèrement courbée. Il mesure entre 1 et 5 µm de long par 0,5 à 1.0 µm de large. Plusieurs isolats ont démontré la capacité de croître en anaérobiose en utilisant le nitrate (NO2 - ) comme accepteur final d’électron. Ainsi, le nitrate est réduit en nitrite de même qu’en azote moléculaire. P. aeruginosa est une bactérie motile grâce à la présence d’un flagelle monotriche (un seul) polaire. Cette bactérie est catalase positive et oxydase positive. P. aeruginosa possède une versatilité nutritionnelle remarquable pouvant utiliser une variété de sucres simples et complexes, d’alcools et d’acides aminés comme seule source de carbone. P. aeruginosa est capable de se multiplier à l’intérieur d’un large spectre de température allant de 4 à 45°C. La température optimale de croissance se situe entre 30 et 37°C, ce qui en fait une bactérie mésophile. La morphologie coloniale de P. aeruginosa , de même que pour tout le genre Pseudomonas , est facilement distinctive grâce à la production de pigments verts diffusibles dans le milieu extracellulaire (Palleroni, 1984). Les différentes caractéristiques morphologiques et nutritionnelles de P. aeruginosa sont résumées et comparées aux Pseudomonas spp. au Tableau 1.
a Les nombres dans le tableau font référence aux pourcentages des souches positives pour un test donné.
b Les nombres entre parenthèses font référence au nombre d’isolats inclus dans tous les tests pour chaque souche.
La distribution de P. aeruginosa est très large mais c’est d’abord et avant tout un organisme environnemental que l’on retrouve dans l’eau, le sol et sur la majorité des espèces végétales, incluant fruits et légumes. Notons entre autres : l’eau du robinet, les fluides d’humidification oculaires, les savons, les désinfectants, les onguents et cosmétiques. On le retrouve aussi dans les spas, bains thérapeutiques, ainsi que sur plusieurs surfaces humides comme les lentilles cornéennes, le pommeau de douche, les équipements de dialyse, les appareils d’assistance respiratoire et les cathéters. Sa large distribution et sa grande capacité de survie dans le milieu aqueux, font que cette bactérie est présente en milieux hospitaliers détenant ainsi une grande part des responsabilités des infections nosocomiales. À cause d’une implication clinique majeure, P. aeruginosa est certes le membre le plus étudié du genre Pseudomonas (Grundmann et al. , 1993).
P. aeruginosa n’est, de façon générale, pas un membre de la microflore normale humaine. L’intestin en est colonisé, mais seulement suite à l’ingestion de l’organisme. La colonisation du tractus respiratoire est commune chez les patients hospitalisés et surtout lors de l’intubation. Plus longtemps le patient sera sous assistance respiratoire, plus importante sera la colonisation (Pollack, 1990). Le fait que l’on retrouve P. aeruginosa en milieu hospitalier conduit souvent à des bactériémies à la suite d’une exposition prolongée ou à l’infection d’une plaie post-opératoire.
P. aeruginosa est le pathogène humain le plus important du genre Pseudomonas étant donné le grand nombre et type d’infections causées ainsi que la morbidité et la mortalité qui leurs sont associées (Pollack, 1990). Il est capable de combiner efficacement adaptabilité aux milieux humides et production d’un imposant arsenal de facteurs de virulence. Les affections causées vont d’une simple infection cutanée superficielle à des septicémies fulminantes. Les infections à P. aeruginosa acquises en communauté chez les individus immunocompétents tendent à être localisées et sont fréquemment associées à de l’eau ou de la nourriture contaminée. Les infections causées à l’oeil provoquent souvent des lésions cornéennes. Ce type d’infection est directement lié à l’usage de lentilles cornéennes. Les solutions contaminées pour lentilles ainsi que l’usage de l’eau du robinet pour l’entretien de celles-ci ont été identifiées comme sources de contamination. (Holland et al ., 1993) Les infections oculaires à P. aeruginosa peuvent rapidement mener à la formation d’ulcères de la cornée et à la perte de la vue si l’infection n’est pas traitée promptement. L’infection la plus sévère pouvant être acquise en communauté est l’endocardite provenant des seringues contaminées par les usagers de drogues injectables. Les drogues injectées sont dans beaucoup de cas mélangées avec de l’eau du robinet contaminée par P. aeruginosa causant la bactériémie (Pollack, 1990).
On retrouve également P. aeruginosa sous un phénotype inhabituel que l’on nomme mucoïde chez environ 80% des gens atteints de la Fibrose Kystique (FK). Le phénotype mucoïde de P. aeruginosa se trouve toujours en association avec de graves infections pulmonaires chroniques. On croit que c’est l’environnement inhabituel du poumon FK qui est la cause du changement vers le phénotype mucoïde. La sécrétion d’alginate, un exopolysaccharide complexe, en combinaison avec le mucus épais et collant des voies respiratoires forme un milieu de culture idéal nécessaire à l’établissement d’infections pulmonaires chroniques. Cette barrière servira donc de protection anti-phagocytique de même que d’écran contre les antibiothérapies.
La Fibrose Kystique (FK) est une maladie résultante de différentes mutations du gène codant pour le CFTR « Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator ». Le CFTR est une protéine canal à ions chlorures dépendante de l’AMPc que l’on retrouve à la surface des cellules épithéliales (Rommens et al ., 1989). L’inactivité du CFTR est soit liée à l’absence de production de celui-ci; soit la molécule est incapable d’atteindre son site d’action, ou soit à un défaut de fonction (Bijman et al. , 1987). La conséquence majeure de cette anomalie est l’affaiblissement du transport des ions chlorures à la surface de la cellule. D’autres fonctions ont été attribuées au CFTR telles que la régulation d’une panoplie d’autres canaux qui pourraient, eux aussi, jouer un rôle important dans la pathogenèse de la maladie. Ainsi, la perte d’inhibition des canaux sodiques de l’épithélium mène à l’hyper absorption sodique et favorise une osmose positive vers l’épithélium. Bien que la protéine CFTR soit exprimée dans plusieurs organes, l’effet clinique dominant de la maladie se retrouve au niveau des systèmes respiratoire, gastro-intestinal et reproducteur. De ces zones touchées, les maladies pulmonaires comptent pour plus de 90% des causes de morbidité chez les patients atteints de la FK.
La caractéristique marquante du poumon FK est sa colonisation par une gamme limitée d’espèces bactériennes ainsi que d’une sévère inflammation conduite essentiellement par les neutrophiles. Ces traits apparaissent tôt dans l’évolution de la maladie et persistent dans le temps pour conduire à un état d’infection pulmonaire chronique (Koch and Hoiby, 1993). Le rôle exact de la mutation du CFTR dans la chronologie des évènements conduisant à l’infection pulmonaire chronique et aux dommages irréversibles est en partie inconnu et très controversé. Par contre, la plupart des experts s’entendent pour dire qu’à la naissance, les poumons des bébés FK sont normaux (Chow et al. , 1982; Oppenheimer and Esterly, 1975). Toutefois, de récentes études sur des souris ont avancé que le CFTR pourrait avoir un rôle durant la période foetale. Effectivement, le transfert in utero du gène codant pour le CFTR réduit grandement les effets gastro-intestinaux de la maladie mais ne prévient pas le développement d’une pathologie pulmonaire (Larson et al. , 1997). Chez l’humain FK, l’analyse en continue des voies respiratoires a révélé la présence de microzones d’inflammation dès la petite enfance sans aucune présence de pathogènes cultivables. Ces données portent à croire que la mutation du CFTR lui-même pourrait être responsable de l’état pro-inflammatoire (Abman et al. , 1991). En accord avec cette hypothèse, des études menées sur des voies respiratoires FK humaines à l’état foetal ont montré un haut niveau d’expression de cytokines pro-inflammatoires ainsi qu’une présence leucocytaire accrue aux muqueuses en l’absence d’infection bactérienne (Tirouvanziam et al. , 2000). En opposition à la même hypothèse, des études effectuées sur des lavages broncho-alvéolaires d’enfants FK ont montré un niveau normal de cytokines sans infection bactérienne, mais le déclenchement d’une réponse inflammatoire exagérée dès que des pathogènes envahissent les voies respiratoires (Armstrong et al. , 1995).
Les infections bactériennes associées à la FK surviennent en bas âge et sont difficiles à enrayer. Durant la petite enfance, les infections à Staphylococcus aureus et à Haemophilus influenzae sont communes et par la suite, P. aeruginosa s’installe et devient le pathogène majeur. Des infections chroniques à Pseudomonas sont présentes dans plus de 85% des cas à l’adolescence et du même fait, la bactérie est directement responsable des dommages tissulaires des poumons causés par une réponse inflammatoire agressive. Un plus petit nombre de patients vont se voir colonisés également par d’autres espèces opportunistes comme Burkholderia cepacia , Stenotrophonomas maltophilia et certaines espèces de mycobactéries non-tuberculeuses.
Chez un individu sain, l’entrée de P. aeruginosa dans les poumons est rapidement stoppée par une variété de défenses naturelles composées essentiellement du réflexe mécanique de clairance mucociliaire et de la présence des macrophages alvéolaires. Chez les patients FK, de même que ceux qui sont sous assistance respiratoire, immunodéprimés ou avec des brûlures importantes, ces barrières de défense sont faibles et leur défaillance crée l’opportunité nécessaire à l’établissement d’une infection. Bien que peu connue, on sait que c’est durant les stades précoces de la maladie que l’adhérence à la surface cellulaire des voies respiratoires et la résistance aux défenses innées de l’individu vont survenir. Mais pourquoi ces étapes sont-elles facilitées par l’environnement des voies respiratoires FK? Plusieurs explications ont été avancées dont une composition chimique anormale du liquide de surface des voies respiratoires surtout due à l’excès d’ions chlorures. De ce fait, il s’en suivrait plusieurs conséquences directes dont le fonctionnement inefficace des cils vibratiles des voies respiratoire, une diminution de la réponse des peptides anti-microbiens, un faible niveau de phagocytose et un faible niveau de molécules de défense extracellulaires comme l’oxyde nitrique et le glutathion (Davies, 2002).
Dès que la bactérie a réussi à s’implanter dans les voies respiratoires, elle devra y survivre et ce malgré la présence des défenses de l’hôte, innées et acquises, et d’évènements répétés d’antibiothérapie topique et systémique. Pour réussir ceci, P. aeruginosa devra développer une importante gamme de stratégies immuno-évasives incluant entre autres des protéines à action extracellulaires. Des protéases, des lipases, une phospholipase C hémolytique et des exoenzymes à activité ADP-ribosylation. La sécrétion de ces produits extracellulaires sera accompagnée par d’importants changements phénotypiques dépendants du système du quorum-sensing, comme la mucosité et la formation d’un biofilm, menant à une résistance accrue aux antibiotiques.
L’élastase B (également nommée protéase LasB ou pseudolysine) est une métalloprotéase neutre nécessitant le zinc comme co-facteur pour l’activité enzymatique et le calcium comme stabilisateur (Morihara et al., 1985) L’élastase B est la protéine la plus abondante du surnageant de culture ayant comme principales fonctions le recyclage protéique et la dégradation de la matrice extracellulaire. En effet, LasB dégrade efficacement les constituants majeurs de la matrice de l’épithélium pulmonaire, soient l’élastine, le collagène et la fibrine. LasB s’attaque aussi aux immunoglobulines et aux cytokines comme l’interféron gamma et au facteur nécrosant des tumeurs (TNF) (Park et al. , 1996). De ce fait, l’élastase B est associée aux divers types de pathologies causées par P. aeruginosa et pointée comme étant un facteur de virulence clé (Sawa et al. , 1998). LasB est initialement synthétisée sous la forme d’un précurseur contenant un domaine pré-pro-mature qui consiste en un peptide signal de 23 acides aminés, un propeptide de 174 résidus et un domaine catalytique en C-terminal de 301 acides aminés (Kessler et al. , 1998). Le propeptide est clivé de façon autocatalytique à l’intérieur du périplasme (McIver et al. , 1991). Il se forme immédiatement un complexe inactif entre le propeptide et l’enzyme repliée (Kessler and Safrin, 1994) et c’est sous cette forme que l’enzyme est sécrétée dans l’environnement extracellulaire (Braun et al. , 2000; Kessler et al. , 1998). Bien que le propeptide peut être détecté dans le surnageant de culture, il est rapidement dégradé après la sécrétion de l’élastase laissant uniquement la portion stable de l’enzyme présente à l’extérieur de la cellule.
L’élastase A (également nommée protéase staphylolytique ou staphylolysine) est également une métalloprotéase dégradant l’élastine. Cependant, à elle seule, l’élastase A ne possède pas une grande activité elastolytique, mais elle agirait plutôt en synergie avec LasB, augmentant ainsi le pouvoir de dégradation (Kessler et al. , 1997). Contrairement à l’élastase B, la protéase LasA possède un site de clivage complexe. Effectivement, la protéase coupe le pont peptidique suivant un couple de glycine et plus spécialement lorsque le troisième acide aminé est une autre glycine, une alanine ou une phénylalanine (Kessler et al. , 1997). En revanche, l’élastase A possède une importante activité staphylolytique résultant du clivage du pont pentapeptidique Gly5 que l’on retrouve dans la structure du peptidoglycane de Staphylococcus aureus (Kessler et al., 1993) . L’élastase A est également produite, comme décrit plus haut pour l’élastase B, en pré-pro-enzyme qui devra suivre des étapes de clivages et de repliements successifs avant d’être correctement activée dans le milieu extracellulaire (Kessler et al ., 1998).
La virulence de P. aeruginosa repose également sur la sécrétion d’exotoxines via le système de sécrétion de type III (TTSS) dont les multiples composantes sont hautement similaires à celui retrouvé sur le plasmide de virulence de Yersinia pestis (Hueck, 1998). Le TTSS de P. aeruginosa , aussi connu sous le nom de régulon de l’exoenzyme S, comporte quatre protéines effectrices : ExoS, ExoT, ExoU et ExoY. L’exoenzyme S (ExoS) et l’exoenzyme T (ExoT) possèdent toutes deux une activité d’ADP-ribosylation commune aux protéines de faible poids moléculaire de la famille Ras et liant le GTP (McGuffie et al. , 1998). L’exoenzyme Y (ExoY) est une adénylate cyclase dont l’activité est associée à des changements morphologiques majeurs des cellules épithéliales (Yahr et al. , 1998). L’exoenzyme U (ExoU) a démontré une activité lipase in vitro (Sato et al., 2003) . La production de ces exoenzymes est principalement régulée via l’activateur transcriptionnel ExsA en réponse à différents stimuli environnementaux, comme une baisse de calcium ainsi qu’un contact direct avec des cellules en cultures (Hornef et al. , 2000).
Un autre facteur de virulence important de P. aeruginosa est l’exotoxine A. L’exotoxine A possède également une activité d’ADP-ribosylation qui agit directement sur le facteur II d’élongation eucaryote, inhibant ainsi la synthèse protéique de la cellule cible (Iglewski and Kabat, 1975). La régulation du niveau d’expression de l’exotoxine A est complexe et requiert une cascade de régulation qui résulte en un niveau maximal d’expression dans des conditions où le fer est limité (Vasil and Ochsner, 1999).
Le fer est un élément essentiel à la croissance de tous les organismes vivants, mais dans la majorité des milieux, la concentration du fer bio-disponible (10-7M) est largement en deçà des niveaux requis pour la croissance des bactéries comme P. aeruginosa (Ratledge and Dover, 2000). Les bactéries ont évolué en développant maintes stratégies en vue d’acquérir, transporter et rendre soluble le fer (de Fe2+ vers Fe3+ ) (Guerinot, 1994). La méthode la plus répandue d’acquisition du fer est la production de composés hautement affin pour celui-ci: les sidérophores. Après sa sécrétion, le sidérophore chélate le fer dans l’environnement extracellulaire. Le complexe moléculaire résultant, le ferri-sidérophore, est ensuite transporté à l’intérieur du cytoplasme via des récepteurs membranaires spécifiques pour ces complexes. P. aeruginosa produit un sidérophore majeur appelé pyoverdine. La pyoverdine chargée de fer est transportée via le récepteur membranaire FpvA. La pyoverdine peut également agir comme molécule de signalisation induisant la sécrétion de deux autres facteurs de virulence : l’exotoxine A et l’endoprotéase PrpL (ou protéase IV). L’interaction de la ferri-pyoverdine avec FpvA transduit un signal trans-périplasmique via FpvR, un facteur anti-sigma (voir le chapitre 2 pour une description détaillée des facteurs anti-sigma), qui à son tour provoque l’activation du facteur sigma de type ECF, PvdS, le régulateur transcriptionnel clé du métabolisme du fer chez P. aeruginosa (Beare et al. , 2003). La figure 1 illustre bien l’acquisition du fer chez P. aeruginosa via la sécrétion de la pyoverdine.
Il est connu depuis de nombreuses années que les isolats pulmonaires de P. aeruginosa sont très muqueux. Suivant la colonisation du poumon FK par P. aeruginosa, le phénotype non-mucoïde est invariablement remplacé par le phénotype mucoïde, qui est difficile à éradiquer (Doggett, 1969). La cause de cette mucosité réside dans le fait que P. aeruginosa sécrète un exopolysaccharide en grande quantité nommé : alginate. Physiquement, l’alginate est responsable de la neutralisation des processus immuns de l’hôte comme la phagocytose et l’opsonisation et contribue au ralentissement de la diffusion des radicaux libres comme l’oxyde nitrique (Baltimore and Mitchell, 1982 ; Simpson et al., 1988). L’alginate est un co-polymère, sans répétition, de ß-D-mannuronate (M) et de son C-5 épimère, le α-L-guluronate (G), relié par un pont glycosidique 1 → 4 (Evans and Linker, 1973). La suite des résidus M et G à l’intérieur du polymère conférera les différentes propriétés physiques du gel comme son élasticité et sa viscosité. Chez P. aeruginosa, l’alginate est surtout divisé en bloc qui regrouperont des parties uniquement composées de M, d’autres uniquement de G et finalement, des régions mixtes M et G. Ces différents blocs sont assemblés de manière linéaire et totalement aléatoire (Chitnis and Ohman, 1990). (Figure 2) La production d’alginate est sous le contrôle du facteur sigma alternatif, σ22, codé par algT (Voir chapitre 2). Brièvement, c’est une mutation du facteur anti-sigma Muc A, libérant AlgT, qui force une transcription non-contrôlée des gènes de biosynthèse de l’alginate (Malhotra et al., 2000).
Figure 2. Structure moléculaire de l’alginate. Les deux sous-unités glucidiques, le D-mannuronate (M) et le L-guluronate (G), qui forment le polymère (A). L’assemblage du polymère linéaire d’alginate chez P. aeruginosa via la juxtaposition de blocs : un bloc de M au début de l’assemblage, suivi d’une région mixte M et G puis un bloc de G vers la fin de l’assemblage. (Chitnis and Ohman, 1990)
Chez Pseudomonas aeruginosa, l’orchestration des facteurs de virulence est contrôlée via un système bien connu que l’on nomme quorum sensing (QS). Le QS est sans contredits un mécanisme de régulation clé de la pathogénicité de P. aeruginosa permettant d’importants changements phénotypiques visant la colonisation de l’hôte (Parsek and Greenberg, 2000). Le système repose sur la diffusion et la détection de petites molécules produites dans l’environnement, les homosérines lactones (HSL). C’est la concentration des HSL retrouvées dans un milieu donné, directement liée à la densité cellulaire, qui permettra l’activation en cascade de deux systèmes inductibles de type Lux R et Lux I. Les systèmes Las et Rhl dont l’activation repose sur la concentration des molécules 3-oxo-C12-HSL et C4-HSL respectivement, sont le point de départ du mode virulence de P. aeruginosa(Figure 3) (Latifi et al., 1996; Pesci et al., 1999). Des études de transcriptome des gènes contrôlés par les circuits LasIR (dépendant de la molécule 3-oxo-C12-HSL) et RhlIR (dépendant de la molécule C4-HSL) du QS ont mis en évidence trois classes de gènes. La première classe comprend les gènes qui répondent à seulement un auto-inducteur, la deuxième regroupe ceux qui peuvent être activés par une voie ou l’autre et la dernière classe inclut ceux qui nécessitent l’activation des deux voies (Schuster et al., 2003; Wagner et al., 2004). De plus, les analyses de la transcription à l’aide de puces à ADN ont démontré que ces classes de gènes sont exprimées à des niveaux différents dépendamment de la phase de croissance de la culture. Ceci indique que l’architecture en tandem de ces deux réseaux nécessite une séquence d’événements coordonnés dans le temps incluant une expression transitoire de certains gènes pour l’implantation d’une infection fructueuse (Schuster et al., 2003; Whiteley et al., 1999).
En plus de 3-oxo-C12-HSL et de C4-HSL, P. aeruginosa sécrète le milieu extracellulaire du 4-quinolone comme autre molécule du QS. La synthèse et l’activité biologique de celle-ci ont été rapportées par la littérature comme étant liées aux systèmes las et rhl . La composition chimique exacte de cette molécule est 2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone que l’on nomme «Pseudomonas Quinolone Signal» (PQS) (Pesci et al. , 1999) (figure 3). Il a été démontré que LasR régule la production de PQS induisant ainsi l’expression de lasB , rhlI et rhlR (McKnight et al. , 2000; Pesci et al. , 1999) suggérant que l’activité dépendante du PQS constitue un lien de régulation important entre las et rhl . Toutefois, McKnight et al. 2000 proposent que le PQS n’est pas impliqué dans le contrôle de la densité cellulaire, mais plutôt dans le cycle de croissance, une caractéristique typique des molécules du QS. (Voir la figure 4 qui résume la voie de régulation du QS)
Il a été démontré que l’établissement d’un biofilm bactérien à l’intérieur des voies respiratoires des patients FK est une étape critique dans le changement phénotypique de P. aeruginosa vers un mode virulent. Les micro-organismes favorisent en général un mode de vie où la population cellulaire se retrouve fixée à un support (état sessile) plutôt que libre dans le milieu environnemental (état planctonique). L’attachement à une surface permet à la bactérie de s’installer et de coloniser un environnement. Après attachement sur un support, les bactéries vont mettre en place et développer une communauté organisée à laquelle on a attribué le nom de « biofilm » (Costerton et al., 1999). Le biofilm se définit donc comme une population bactérienne adhérée à une surface et enrobée d’une matrice d’exopolysaccharide. La première étape de l’attachement fait intervenir les structures de locomotion comme les flagelles et les pilis de type IV (O'Toole and Kolter, 1998). Cette approche mène à un attachement transitoire. En deuxième lieu, une association stable avec la surface ou avec d’autres micro-organismes s’établit. Ces rassemblements de bactéries conduisent à la formation de micro-colonies dont la différenciation mène à l’élaboration du biofilm. La matrice d’exopolysaccharide de P. aeruginosa est essentiellement composée d’alginate et représente environ 85% du volume total. Cette matrice renforce la structure du biofilm tout en lui conservant une grande élasticité. À l’intérieur du biofilm, les micro-colonies sont séparées par un réseau de canaux circulant permettant, d’une part, d’acheminer l’oxygène et les nutriments à l’intérieur du biofilm, et, d’autre part, d’évacuer les déchets. Les molécules solubles peuvent diffuser à travers la matrice d’exopolysaccharide et être utilisées par les cellules. Un gradient de nutriments et d’oxygène est observable depuis le sommet du biofilm jusqu’à sa base où l’anaérobiose y règne. Ces observations sont en accord avec l’idée selon laquelle l’état métabolique d’une bactérie à l’intérieur d’un biofilm dépend de sa localisation au sein de la structure (Ramsey and Whiteley, 2004). La figure 5 illustre bien le cycle de formation d’un biofilm chez P. aeruginosa .
Il est maintenant bien connu que P. aeruginosa , de même que les autres bactéries à Gram-négatif, possède une résistance intrinsèque aux antibiotiques. Cette résistance est entre autre due à la restriction des imports à travers la membrane externe, de même que des systèmes secondaires d’efflux dépendants d’énergie et de ß-lactamases (Hancock, 1997) Donc, l’importance d’une perméabilité restreinte au niveau de la membrane externe est claire car l’utilisation d’agents qui brisent la barrière externe (comme les peptides cationiques) ou des mutations qui créent de larges pores rendent les cellules beaucoup plus susceptibles à l’antibiothérapie (Huang and Hancock, 1996). La masse d’information récemment révélée sur les systèmes à efflux de P. aeruginosa a permis de conclure qu’ils constituaient l’élément clé de la grande résistance intrinsèque aux drogues de cette bactérie. Toutefois, il n’existe pas de différences majeures au niveau des mécanismes d’action ou de l’efficacité des systèmes à efflux de P. aeruginosa (comparée à Escherichia coli par exemple) (Nikaido, 1994). C’est plutôt la différence de perméabilité membranaire de P. aeruginosa chiffrée entre 10 fois et 100 fois plus basse que les autres Gram-négatif (Nikaido and Hancock, 1986). Il est à noter toutefois que la faible perméabilité de la membrane externe de P. aeruginosa n’est pas le seul facteur à considérer (Nikaido, 1994). En effet, elle sert également à ralentir l’entrée des drogues pour faciliter l’action des mécanismes de résistance secondaires tels que l’efflux et la dégradation de ces substances.
La membrane extracellulaire des bactéries à Gram-négatif est constituée d’une bicouche phospholipidique, de lipopolysaccharides (LPS) et de protéines qu’on nomme porines. Les porines forment des canaux permettant la diffusion des molécules hydrophiles. OprF est sans contredit la porine majeure de P. aeruginosa et facilite la diffusion de grosses molécules comme des di- ou tri-saccharides et possiblement des antibiotiques (Bellido et al. , 1992). Deux systèmes à efflux ont été décrits comme jouant un rôle dans la résistance intrinsèque de la bactérie aux antibiotiques basée sur une expression constitutive et par l’influence de mutations nulles et/ou inhibitrices. Le premier système est celui de MexAB-OprM (Zhao et al. , 1998). Ce système est un prototype du système RND (resistance-nodulation-division) contenant une pompe cytoplasmique, MexB, une protéine périplasmique de liaison, MexA et une protéine de la membrane externe (OMP) OprM. Des mutations affectant n’importe quelle de ces protéines résultent en une hypersensibilité aux quinolones, tétracyclines, chloramphénicol, sulfamethoxazole, triméthoprime et quelques ß-lactames mais pas aux aminoglycosides, érythromycine et polymixines (Nikaido, 1994; Zhao et al. , 1998). D’autre part, le second opéron de pompe à efflux, MexX-MexY, en collaboration apparente avec OprM a été récemment impliqué dans la résistance intrinsèque aux aminoglycosides et à l’érythromycine (Aires et al ., 1999; Westbrock-Wadman et al ., 1999).
Comme discuté ci-haut, l’établissement d’une infection opportuniste à P. aeruginosa est multifactorielle. L’absence de traitements efficaces contre la FK, la résistance accrue aux antibiotiques et le peu d’informations disponibles concernant les caractéristiques in vivo d’une infection pulmonaire chronique font ressortir les besoins de nouvelles pistes de recherche pour développer des outils thérapeutiques efficaces et enrayer les problèmes d’infection persistante dus à P. aeruginosa. Ainsi nous croyons que l’identification de gènes essentiels à l’établissement d’une infection in vivo pourrait permettre de répondre en partie à la problématique soulevée. Nous soumettons l’hypothèse que les informations récentes issues du séquençage génomique de la souche PAO1couplées aux nouvelles technologies de mutagenèse en masse permettront l’identification de nouveaux gènes impliqués dans la pathogénie de la bactérie. Ces protéines ayant une fonction inconnue à ce jour fourniront ainsi une meilleure compréhension de l’orchestration génique des facteurs de virulence proposant de nouvelles pistes thérapeutiques. L’objectif général de cette présente thèse est donc d’identifier des gènes in vivo essentiels à la pathogénie et au maintient de P. aeruginosa utilisant une technologie de mutagenèse par étiquette dans un modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat.
Dans le but d’identifier de nouveaux gènes associés à l’infection in vivo chez P. aeruginosa , la technologie de la STM (Signature-Tagged Mutagenesis) a été utilisée. La STM consiste en une sélection négative de mutants transpositionels atténués en virulence après passage dans un animal. Le modèle choisi pour le criblage de la banque de mutants construite est l’infection pulmonaire chronique chez le rat utilisant les billes d’agar (Cash et al ., 1979). Une sélection négative par PCR, des mutants récupérés dans les poumons du rat, a permis d’identifier ceux-ci comme atténués dans le maintien de l’infection. Les informations tirées de la séquence du génome de P. aeruginosa ont servi à cibler de façon précise les gènes touchés par les mutations. Étant donné que moins de 7% des gènes de P. aeruginosa ont une fonction connue (Stover et al ., 2000), des études de bioinformatique ont été faite sur chaque mutant STM dont le gène a été cloné et séquencé dans le but d’en connaître l’organisation génique, la fonction probable attribuée à la protéine, les homologues connus chez d’autres espèces bactériennes, les domaines ou motifs conservés des produits de gène. Ces informations ont permis de faire ressortir une implication positive ou négative potentielle dans l’établissement d’une infection et de concentrer nos efforts sur quelques mutants sélectionnés.
La STM (Signature-Tagged Mutagenesis) est une technique permettant de rechercher des facteurs de virulence à grande échelle, par sélection négative in vivo, en construisant des mutants par transposition (Shea et al ., 2000). Chaque mutant à tester contient sa signature d’ADN personnelle via un oligonucléotide qui le rend unique. À l’origine, la STM a été créée utilisant un système de criblage à hybridation différentielle (Hensel et al ., 1995), mais nous avons raffiné la technique en criblant par PCR, ce qui donne des résultats plus spécifiques tout en étant plus sensible (Lehoux et al ., 2002a; Lehoux et al ., 2002b). L’absence d’un mutant du groupe de récupération à la sortie du modèle animal comparativement à sa présence dans le groupe d’entrée constitue un mutant atténué (voir la figure 6 et l’article en appendice 1 de la présente thèse). Nous avons choisi d’utiliser la STM à d’autres techniques comme IVET (In Vivo Expression Technology) (Chiang et al ., 1999) car la STM est une méthode relativement rapide, permettant de chercher des gènes de virulence à l’intérieur d’une population mixte de mutants utilisant le même animal.
Des modèles animaux naturels de la FK n’ont pas encore été identifiés à ce jour, et ce malgré un effort soutenu de criblage chez les primates non humains (Glavac et al ., 2000) résultant en une panoplie de modèles animaux développés. L’administration d’une suspension libre de P. aeruginosa dans les voies respiratoires d’un mammifère, comme le rat ou la souris, constitue un excellent modèle d’étude des infections aigues à P. aeruginosa . Cependant, comme P. aeruginosa est un pathogène opportuniste, la dose est cruciale ; si l’inoculum est trop faible, il y aura exclusion par l’hôte et si l’inoculum est plus élevé, l’organisme mourra d’une septicémie aigue (Southern et al ., 1970). Cash et collaborateurs (1979) ont développé un modèle d’étude qui est rapidement devenu le modèle de prédilection dans l’étude des infections pulmonaires chroniques à P. aeruginosa : le modèle des billes d’agar chez le rat. Il est maintenant bien établi que le fait d’inclure l’inoculum bactérien à l’intérieur de billes d’agar, a pour effet de protéger celui-ci des défenses de l’hôte et de l’exclusion mimant ainsi l’épaisse couche d’alginate protectrice. De plus, les dommages tissulaires causés par l’inflammation dans les poumons FK sont sensiblement les mêmes que l’on retrouve dans un contexte d’infection pulmonaire chronique chez le rat (Cash et al., 1979). Brièvement, un inoculum standardisé à 1 x 106 cfu total de cellules de P. aeruginosa , provenant d’une culture de seize heures, est mélangé à une solution d’agarose maintenue liquide à 55°C. Par la suite, la suspension de cellules et d’agarose est ajoutée graduellement à de l’huile minérale en agitation rapide, également à 55°C, dans le but de former une émulsion. Finalement, l’émulsion est rapidement refroidie en ajoutant de la glace à l’extérieur du contenant et les billes sont récoltées et lavées par décantation utilisant un sel biliaire, le déoxycholate de sodium. La taille moyenne des billes ainsi générées est de l’ordre de 10 à 100 µm (voir la figure 7).
© Éric Potvin, 2007
| | | |
 | Chapitre 2 Régulation transcriptionnelle chez Pseudomonas aeruginosa |
