Chapitre 2 MATÉRIELS ET MÉTHODES

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La souche E. coli DH5α utilisée pour la plupart des clonages a été traitée au chlorure de rubidium et congelée à -80oC (Utermohlen, 1994). Tout d’abord, 200 ml de milieu LB sont inoculés avec 2 ml d’une culture en phase stationnaire. La culture est incubée à 37oC sous agitation rapide jusqu’à l’obtention d’une D.O. 600nm située entre 0,4 et 0,6. La culture est par la suite centrifugée dans des tubes de 250 ml dans une centrifugeuse Sorvall à 4oC, pendant 5 minutes à 5000 tr/min. Les manipulations sont toujours effectuées avec des solutions stériles et préalablement refroidies sur la glace. Les cellules sont remises en suspension dans 80 ml de TBF1 (KOAc 30 mM, RbCl 100 mM, CaCl2 10 mM, MnCl2 50 mM, glycérol 15%, pH 5,8) puis incubées sur la glace pendant 5 minutes. Les cellules sont à nouveau centrifugées 5 minutes à 5000 tr/min et elles sont remises en suspension dans 8 ml de TBF2 (MOPS ou PIPES 10 mM, CaCl2 75 mM, RbCl 10 mM, glycérol 15%, pH 6,5) et incubées pendant 15 à 60 minutes sur glace. On peut ensuite faire des aliquotes de 200 μl et congeler rapidement les cellules à -80oC. Elles peuvent être conservées au moins un an dans ces conditions.

Pour ce qui est de la souche E. coli XL1-Blue, elle a été traitée au chlorure de calcium et gardée à 4oC pour moins d’une semaine. Pour ce faire, 50 ml de milieu LB sont inoculés avec 2 ml d’une culture en phase stationnaire. La culture est incubée à 37oC sous agitation rapide jusqu’à l’obtention d’une D.O. 600nm d’environ 0,5. Les cellules sont déposées sur la glace et 40 ml sont prélevés pour être centrifugés dans un tube stérile d’une centrifugeuse Sorvall. Après une centrifugation de 5 minutes à 3000 tr/min à 4oC, le culot est remis en suspension dans 5 ml d’une solution de CaCl2 50 mM stérile préalablement refroidie. Les cellules sont ainsi traitées pendant 20 minutes. Il y a par la suite une centrifugation de 5 minutes à 3000 tr/min à 4oC et le culot est remis en suspension dans 1 ml de la même solution de CaCl2. Les cellules sont toujours gardées sur la glace.

Lors de la transformation, les cellules compétentes sont gardées sur la glace. On les met en présence de l’ADN (50 à 200 ηg) pour une période d’une heure. Un choc thermique de 5 minutes à 37oC ou d’une minute à 42oC est ensuite effectué. Les cellules sont déposées sur la glace pour environ 3 minutes avant d’ajouter 0,5 ml de milieu LB. On laisse incuber les cellules à 37oC sans agitation avant de les étaler sur un milieu LB solide contenant de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml. Si le plasmide utilisé est pBluescript, on peut sélectionner les colonies blanches en étalant sur le milieu 50 μl de X-gal 2% et 50 μl d’IPTG 100 mM. Les boîtes sont finalement incubées pour 24 heures à 37oC.

Tous les plasmides obtenus à la suite d’une transformation ont été isolés pour vérification par la méthode d’isolement de l’ADN plasmidique employant le CTAB (bromure d’hexadécyltriméthyl ammonium). Les transformants sont tout d’abord repiqués dans 3 ml de milieu LB avec de l’ampicilline pour une incubation sous agitation à 37oC pour toute la nuit. Par la suite, 1,5 ml de chaque culture sont transférés dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et centrifugés 1 minute à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse. Le culot est suspendu dans 200 μl de tampon STET (sucrose 8%(P/V), Tris·HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 50 mM, Triton 0,1% (V/V)). On ajoute ensuite 4 μl de lysozyme 50 mg/ml et on laisse reposer 5 minutes à la température ambiante. Les tubes sont transférés dans l’eau bouillante pour 45 secondes. On centrifuge à vitesse maximale 10 minutes et on élimine le culot visqueux à l’aide d’un cure-dent. Le surnageant est ensuite traité avec 2 μl de RNase 10 mg/ml pendant 10 minutes à 68oC. Un volume de 10 μl de CTAB (CTAB 5% (P/V) dans NaCl 0,5 M) est ajouté. Les tubes sont agités et centrifugés 10 minutes à vitesse maximale. Le surnageant est éliminé et le culot est rapidement solubilisé dans 300 μl de NaCl 1,2 M. On précipite l’ADN en ajoutant 750 μl d’alcool éthylique 95% et en déposant les tubes sur la glace 10 minutes. Finalement on centrifuge les tubes pendant 10 minutes. On peut effectuer un autre lavage avec 250 μl d’alcool éthylique 95% suivi d’une centrifugation de 2 minutes. Le culot d’ADN est enfin dissout dans 20 μl de TE (Tris·HCl 10 mM pH 8, EDTA 1mM pH 8,0).

Les différents plasmides utilisés dans cette étude sont décrits au Tableau 4. Tout d’abord, il y a eu amplification par PCR du gène ARF3 avec son promoteur à l’aide des oligonucléotides ARF3-5’ Bam HI et ARF3-3’ Bam HI (Tableau 5) ce qui a permis d’avoir deux extrémités collantes. Le gène avec son promoteur a été cloné dans le site Bam HI du vecteur multicopie de levure YEp24.

La mutagenèse dirigée a été effectuée sur des sites particuliers afin d’obtenir différentes mutations sur la protéine Arf3p. Le gène ARF3 et son promoteur ont été insérés dans le vecteur pBluescript puisque la méthode de mutagenèse dirigée par PCR demande un plasmide ayant une taille relativement petite. Pour ce faire, un nouveau PCR d’ ARF3 avec les oligonucléotides ARF3-5’ Bam HI et ARF3-3’ Eco RI (Tableau 5) a été réalisé. Ce fragment a ensuite été cloné dans les sites Bam HI et Eco RI de pBluescript (pBs- ARF3 ). Le protocole de mutagenèse dirigée a été effectué selon le QuickChange™Site-Directed Mutagenesis Kit vendu chez Stratagene®.

La GFP (Green Fluorescent Protein) a été utilisée afin d’établir la localisation d’Arf3p. Elle provient du plasmide p2312MAL et elle contient 239 acides aminés (Cormack et al., 1997). Elle a été amplifiée en utilisant les oligonucléotides yEGFP3A et yEGFP3B et elle a été clonée dans les sites Spe I et Bam HI de pBluescript. Le gène ARF3 est amplifié avec les oligonucléotides ARF3 -5’ Eco RI et ARF3 -3’ STOP Bam HI (Tableau 5) afin d’enlever le codon stop et ainsi permettre l’expression de la protéine de fusion Arf3pGFP. ARF3 sans le codon stop a été inséré dans les sites Eco RI et Bam HI de pBs-GFP. L’acide aminé lysine à la position 182 est remplacé par une glycine et le codon stop par une sérine, ensuite le codon d’initiation de la GFP débute. La construction a été séquencée à l’aide de l’oligonucléotide interne dans ARF3 , ARF3 -INT, pour s’assurer que les deux protéines sont en phase. Finalement, le fragment ARF3 -GFP a été inséré dans les sites Kpn I et Sac I de pRS316 et pRS426.

La construction du double mutant pfy1-111 arf3∆ consiste en la délétion du gène ARF3 dans la souche BHY46 ( pfy1-111 ) à l’aide de la méthode PCR (Baudin et al., 1993). Le gène de la kanamycine et les séquences aux extrémités d’ ARF3 sont amplifiés avec les oligonucléotides ARF3Kan-5’ et ARF3Kan-3’ (Tableau 5). Le produit PCR est par la suite transformé dans la souche BHY46 pour donner la souche EHZ200 (Zakrzewska et al., 2003). Les deux mutations ont été vérifiées par PCR et la délétion d’ ARF3 a également été confirmée par Southern.

Une partie importante de cette étude est l’observation microscopique des diverses souches. Pour ce faire, il y a visualisation du cytosquelette d’actine en plus de la morphologie cellulaire. La localisation d’Arf3p-GFP est également visualisée en microscopie.