Les cellules de rayons sont habituellement allongées radialement et ont des parois relativement minces. Cependant, certains érables présentaient des particularités à ce niveau. Des cellules de rayon très trapues, soit courtes et à parois épaisses, étaient particulièrement évidentes à l’occasion chez certains arbres (figure 6). L’activation des rayons amène une grande accumulation de produits de défense qui sont souvent de nature phénolique. Les rayons composant les M3 contiennent donc beaucoup de bleu comme on le voit bien à la figure 8.

Les fins de cerne annuel réagissent elles aussi de façon plus ou moins variable (figure 7). Ces réactions permettent souvent de mieux localiser la position des murs 3. L’accumulation de phénols à cet endroit est souvent notable (figure 8). On voit aussi à la figure 6 une grande quantité de substances réagissant entre les rayons. Ceci est très intéressant et laisse présager un M3 très fort.

Les vaisseaux contiennent fréquemment des occlusions colorées en rouge par la safranine O. Ce rouge semble bien correspondre à des descriptions précédentes d’occlusions des vaisseaux qui contenaient de la pectine (Rioux et al. 1998) (figures 6, 8, 9 et 10). Toutefois, les essais de marquage avec un anticorps contre la pectine n’ont pas permis à ce jour de prouver hors de tout doute la présence de cette substance chez ces occlusions. Il est important de préciser ici que l’érable est un bois très dur et donc particulièrement difficile à travailler. Obtenir des coupes très minces pour la MET n’est pas tâche facile et souvent les grilles utilisées doivent être recouvertes de Formvar pour s’assurer d’une bonne stabilité sous le faisceau d’électrons. Ainsi traitées, il est par contre un peu plus difficile d’obtenir une bonne résolution en MET. L’observation des coupes sous lumière polarisée révèle la présence de cristaux chez certaines de ces occlusions. Le vaisseau au centre de la figure 11 semble contenir des cristaux qui pourraient bien être composés de silicium et/ou de calcium. Ces éléments ont été détectés par microanalyse aux rayons X dans des vaisseaux obstrués de l’érable à sucre (D. Rioux et J.P. Renaud, résultats non publiés). Le silicium peut être présent dans différentes structures de défense (Heath 1981) et récemment il a aussi été associé à la production de phytoalexines de nature phénolique (Bélanger et al. 1995, Fawe et al. 1998). La présence de calcium a aussi été mentionnée chez le hêtre (Bonsen et Walter, 1991) et s’il était prouvé que la pectine se retrouve dans ces mêmes vaisseaux, il serait possible de penser que des pectates de calcium pourraient former certains de ces bouchons. Les pectates de calcium aideraient à maintenir la bonne cohésion des parois cellulaires (Alberts et al. 1989) et ils pourraient ainsi fortifier la structure de certaines occlusions observées dans les vaisseaux. Même sans connaître la composition exacte de ces occlusions à ce stade-ci, leur présence dans les vaisseaux du M3 est des plus intéressante. En effet, elles sont souvent nombreuses dans les M3, permettant ainsi une meilleure étanchéité des murs en hauteur.

Les M4 sont beaucoup plus évidents que les M3. Ils sont habituellement bien délimités et facilement observables en microscopie si les échantillons ont été pris à l’endroit approprié. Ceci est assez facile car les M4 sont aisément repérables à l’œil nu. En effet, une coloration verte ou noire aux abords du bois coloré brunâtre permet habituellement de localiser la barrière. Les M4 débutent avec le nouveau cerne au printemps (figure 12) et ils sont produits en réaction à la blessure. Les M4 sont différenciés par le cambium qui déclenche la formation de cellules adaptées à la défense du xylème. Au moment de la lésion, ces cellules n’existent pas. On retrouve dans les M4 différents types de cellules, soit majoritairement des cellules de parenchyme accompagnées de quelques fibres et vaisseaux. Un de rôles du mur 4 serait de protéger le cambium; en effet, un cambium trop endommagé signifierait la mort de l’arbre (Rioux, 1995).

Le M4 est le mur le plus efficace du système et le plus durable aussi (Shigo 1984). Un beau M4 sera homogène et fort et composé de plusieurs couches de cellules activées. Les M4 de ce type seront dit normaux, surtout s’ils sont de largeur et d’intensité uniformes (figures 12, 14, 24 et 28). L’accumulation de phénols dans les différents types de cellules de ce mur a été notée fréquemment. Dès le début du cerne, une importante coloration bleue foncée, presque noire, est observée. Cette coloration est due à la toluidine O qui se lie aux différents phénols présents (figures 13, 15, 25). Ces phénols sont opaques aux électrons en microscopie électronique (figures 31, 33, 35, 36 et 37). Ces phénols assureront principalement la défense en évitant la colonisation du bois sain produit suite à la lésion. Les substances de défense produites servent avant tout à empêcher la propagation des microorganismes, principalement des champignons associés à la coloration et la carie du bois.

Le cambium va aussi faciliter la défense en limitant la production de vaisseaux. Peu de vaisseaux sont retrouvés dans un M4, surtout au début, et leur taille est relativement petite (la figure 12 est encore ici un bon exemple). S’ils sont plus gros, ils deviennent

Description des figures 12 à 23.

Pour les figures 12 à 17, 22 et 23. le cambium est à droite. Pour les figures 19 et 20 le cambium est vers le haut. Pour les figures 18 et 21, il est à gauche.

Figure 12  : M4 dit ‘’normal’’. Il contient une grande quantité de substances antimicrobiennes au départ, peu de vaisseaux (V) et des rayons multisériés. Il est d’une largeur uniforme.

Figure 13  : M4 normal à fort grossissement. Les vaisseaux contiennent des occlusions et sont souvent segmentés (flèche). Il y a beaucoup de bleu associé aux phénols.

Figure 14  : M4 comme à la figure 12, mais un peu moins uniforme et dense.

Figure 15  : Cellules de rayon activées d’un M4. Le rayon (R ) est multisérié. Il y a peu de vaisseaux, ils sont petits et contiennent des occlusions. Les substances foncées correspondent à des phénols.

Figure 16  : M4 incomplet. On note peu de réactions qui pourraient être associées à un M4. La flèche bleu indique l’endroit le plus probable du M4 qui est peu évident. Il y a beaucoup d’occlusions dans les vaisseaux du bois affecté par l’entaillage.

Figure 17  : Cellule entre deux vaisseaux avec des parois multiples et une grande quantité de grains d’amidon à l’intérieur. Il y a aussi des cellules emplies de phénols (flèche).

Figure 18  : Il n’y avait pas de M4 dans cet échantillon. Une grande variété de réactions sont notées comme les occlusions dans les vaisseaux et beaucoup de phénols dans les rayons.

Figure 19  : M4 complet comprenant plusieurs zones rosées (ZR) dans lesquelles il n’y a pas de vaisseaux. Il y a de fortes réactions dans le bois atteint.

Figure 20  : M4 (flèche) incomplet et très mince. Les réactions qu’on y observe sont peu intenses. Il y a beaucoup de gros vaisseaux.

Figure 21  : Le M4 semble débuter normalement au départ (flèche bleue), mais rapidement, le cambium s’est mis à produire d’importantes zones rosées.

Figure 22  : Échantillon probablement pris trop près de la blessure, car la zone rosée fait ici partie de l’écorce qui est reconnaissable aux différentes couches la composant.

Figure 23  : Mince bande rosée au début d’un M4. Cependant, le M4 qui suit est peu large et faible.

Description des figures 24 à 28

Sur les figures 24 et 27, le cambium est vers le haut. Sur la figure 25 et 26 le cambium est à droite. Sur la figure 28, le cambium est à gauche.

Figure 24  : M4 en deux parties aussi fortes l’une que l’autre. Le premier M4 débute avec le nouveau cerne et contient quelques vaisseaux. Ce mur semble complet. Après un retour à la normale, il y a un nouveau M4. Des occlusions contenant des composés phénoliques en bleu sont aussi visibles dans certains vaisseaux.

Figure 25  : Grossissement du premier M4 de la figure 24. Il y a beaucoup de phénols et peu de vaisseaux (V).

Figure 26  : Rayon fortement activé. Il est large de plusieurs cellules qui sont trapues. Ces cellules contiennent beaucoup de phénols.

Figure 27  : Après le M4, il est facile d’apercevoir l’écorce de l’arbre.

Figure 28  : M4 très large avec beaucoup de réactifs réagissant au bleu de toluidine O. Il est aussi intéressant de remarquer que la croissance avant la blessure était lente et que suite à celle-ci, elle a été activée.

alors souvent obstrués (figure 15). Ceci a pour but de limiter encore une fois la propagation longitudinale des microorganismes, les vaisseaux étant les éléments assurant le passage de la sève brute. Les vaisseaux produits au début du M4 sont fréquemment segmentés et emplis de phénols et d’autres types d’occlusions. Graduellement, les vaisseaux retrouvent leur taille et forme habituelles lorsque le cambium recommence à produire du bois sain (figure 28).

Comme mentionné plus tôt, les rayons des érables à sucre sont ordinairement unis ou bisériés. Cependant, dans un M4, presque tous les rayons deviennent multisériés, ayant 5 à 8 cellules de large. Des rayons plus larges ont aussi été rapportés dans des murs 4 par d’autres chercheurs (Rioux et Ouellette, 1991; Shigo et Tippett 1981). Ces rayons contiennent aussi généralement des phénols (figures 15 et 26). Cette réaction était observée chez presque tous les M4. Avec la formation de rayons plus imposants, l’arbre nuit à la propagation des microorganismes et favorise l’accumulation d’une bonne quantité de produits antimicrobiens. Un champignon qui voudrait traverser un rayon de cette composition rencontrerait une résistance importante qui diminuerait grandement ses chances de réussite.

Une autre substance souvent retrouvée dans les M4 est l’amidon (figures 17, 29, 30, 31 et 32). Les grains sont souvent très nombreux au début du mur. On note leur présence principalement dans les cellules de parenchyme axial, mais aussi dans les rayons. L’amidon est la principale substance de réserve des plantes. C’est à partir de ces sucres que les phénols de défense sont produits. L’accumulation d’amidon se produit surtout au cours de la saison chaude, soit d’avril à octobre (Kozlowski et Pallardy 1997). Comme les échantillons ont tous été prélevés au début de l’automne, il est normal de retrouver beaucoup de grains d’amidon. Cependant, les quantités retrouvées dans certains murs 4 sont plus importantes que celles rapportée dans la littérature. De plus, l’accumulation d’amidon dans le bois atteint et sain, de même que dans les M3, n’a été que rarement observée. Comme le M4 est un moyen de défense actif de l’érable à sucre, il est normal que l’arbre tende à emmagasiner divers composés pouvant faciliter sa survie. En favorisant le dépôt d’amidon, l’arbre peut ainsi s’assurer qu’il aura les ressources nécessaires au déploiement de sa résistance. La fabrication de composés secondaires comme les phénols demande beaucoup d’énergie à l’arbre, comme démontré lors de la formation de murs 4 chez des ormes atteints par la maladie hollandaise de l’orme (Shigo et al. 1986). Il est approprié de se demander ce qui pousse l’arbre à stocker ainsi l’amidon dans cette zone particulière. Il a été déjà rapporté que les M4 contiennent habituellement une grande quantité de phytoalexines (Shigo 1984), mais aucune mention d’amidon sans transformation subséquente en matériaux de défense n’a pu être retrouvée dans la littérature. L’amidon est retrouvé autant dans les échantillons prélevés suite à des blessures vieilles de 6 mois que celles de 18 mois. Aucun des six traitements phytohormonaux ne semble favoriser une plus grande déposition d’amidon. En outre, l’accumulation est considérable dans des zones intimement associées à des cellules ayant aussi accumulé des phénols (figure 30). L’amidon est aussi retrouvé dans les rayons médullaires qui sont des tissus spécialisés dans ce genre de stockage. Il est important pour l’arbre de maintenir ses réserves à un certain niveau s’il veut survivre aux divers stress qu’il va inévitablement rencontrer. Selon Pearce (1996), la chute des réserves en amidon pourrait nuire aux possibilité de défense des plantes en réduisant la qualité des réactions de défense.

Lorsque le cambium forme un M4, il semble devenir hyperactif. Il produit une grande quantité de cellules diverses, qui contiennent généralement diverses substances reliées à la défense. Lorsque la coupe est assez grande, on peut noter que la croissance est de beaucoup plus importante à partir du nouveau cerne qui forme le M4 (figure 28). Les parois des cellules sont en général plus épaisses et peuvent être formées de couches multiples.

Un fait nouveau remarqué chez les murs 4 des érables à sucre est la présence d’une importante zone rosée au début du mur suite à une coloration toluidine-safranine décrite plus tôt (figures 19, 21, 22, 23, 27 et 29). Cette zone contient ou non de l’amidon (figure 30) et semble ne pas absorber les colorants. La cause de cette étanchéité n’a pu être analysée en profondeur, mais ne semble pas due à la subérine. La résine utilisée pour enrober les échantillons ne semble pas avoir bien pénétré cette zone puisque les coupes se brisaient souvent à ce niveau. La zone rosée ne semblait pas interrompre la continuité des murs 4. Les M4 à zone rosée n’ont pu être associés à un traitement bien que certains arbres semblaient plus enclins à en former. Les zones rosées ressemblaient beaucoup à certaines zones de l’écorce particulièrement lorsque les échantillons étaient prélevés très près des blessures (figures 22 et 27). Mais ce raisonnement n’a pas permis d’expliquer la présence de toutes ces zones. Certaines n’étaient pas très grandes et étaient localisées tout juste au début du M4, ce qui ne correspondait pas à la proximité de la blessure d’entaillage. En microscopie électronique, ces zones ne présentaient aucune caractéristique particulière, à part un épaississement des parois des cellules (figures 17 et 34).

On a aussi rencontré des murs incomplets. Ces murs contenaient peu de phénols et les réactions semblaient aléatoires. De plus, on ne retrouvait pas de barrière évidente dans l’échantillon. Un bon exemple est la figure 16. Habituellement, un M4 débute avec un nouveau cerne, sauf qu’ici, le M4 est faible au début du cerne et l’arbre a fait un second essai de barrière un peu plus tard qui est loin d’être aussi efficace que les murs dit ‘’normaux’’. Cependant, dans certains cas comme celui présenté à la figure 18, l’échantillon ne comprenait tout simplement pas de M4 et seulement du bois atteint. Il est possible que cet échantillon ait été prélevé au mauvais endroit car l’observation macroscopique du bois avant fixation avait permis de distinguer une bande verte qui paraissait être un M4. Le M4 présenté à la figure 20 est lui aussi incomplet, même s’il est au début du cerne. Il y a, par endroit, une seule bande de cellules qui réagit, ce qui est peu et ne saurait probablement pas restreindre le passage des microorganismes.

Description des figures 29 et 30

Le cambium est à droite sur la figure 29 et vers le haut sur la figure 30.

Figure 29  : Zone rosée intéressante car elle contient une grande quantité d’amidon et un peu de phénols en plus.

Figure 30  : À plus fort grossissement, on voit bien la quantité impressionnante de grains d’amidon retrouvée dans ce M4. Les ponctuations sont aussi évidentes dans certains cas (flèche).

Description des figures 31 à 39.

Figure 31  : Dans un M4, grains d’amidon dans une cellule de parenchyme dont le cytoplasme contient des phénols. Gross : 11840.

Figure 32  : Dans un M4, grains d’amidon (G) dans une cellule de parenchyme dont la paroi contient plusieurs parois secondaires. Gross : 19920.

Figure 33  : Cellules avec des ponctuations contenant des phénols. Gross : 10260.

Figure 34  : Cellules de parenchyme d’un M4 qui possède sept couches de parois secondaires (montrées par la bande jaune). Gross : 13680.

Figure 35  : Grande quantité de phénol dans le cytoplasme d’une cellule de parenchyme au début d’un M4 à côté d’un vaisseau (V). Gross : 4655.

Figure 36  : Ponctuations (P) entre un vaisseau (V) et une cellule de parenchyme. La cellule de parenchyme contient des composés opaques aux électrons qui sont probablement des phénols. Gross : 12950.

Figure 37  : Ponctuations et plasmodèmes (flèche) qui permettent probablement le passage des phénols d’une cellules à l’autre (flèche jaune). Gross : 15030.

Figure 38  : Cellule subérisé ayant une forme anormale. Les flèches jaunes indiquent des endroits où la couche subérisée qui confère cette forme à la cellule est évidente. Gross : 5150.

Figure 39  : Lamelles de subérine présente dans la membrane (flèche verte). Gross : 41200.

Il est ardu d’imprégner les échantillons avec les agents fixateurs et l’enrobage demande beaucoup de soins. Trouver des lamelles de subérine, en microscopie électronique spécialement, devient dès lors une tâche difficile puisque les tissus subérisés s’imprègnent difficilement et les bris de coupe sont fréquents à ce niveau.

Une caractéristique nouvelle des murs a été découverte au cours de ce projet chez l’érable à sucre. En effet, une autofluorescence jaune a d’abord été localisée dans les murs 3 et ensuite dans les murs 4 sous lumière ultra-violette. Sous lumière bleue, cette autofluorescence jaune devient encore plus évidente (figures 40 et 41). Cette autofluorescence rend généralement les murs continus, ces derniers ayant été décrits originalement comme étant discontinus (Shigo 1984). Cette substance est souvent accolée à la subérine présente aussi dans ces murs. Elle persiste à de longues périodes d’entreposage au froid, mais pas aux traitements de fixation et d’enrobage des échantillons. Cette coloration est observée seulement dans les coupes fraîches obtenues à partir du matériel gardé à –80 °C. Plusieurs colorations ont été essayées pour déterminer la nature chimique de cette autofluorescence comme la réaction acide nitrique de Hoepfner-Vorsatz (Reeve, 1951) qui permet de détecter certains phénols, la coloration à la vanilline-HCl (Sakar et Horwarth, 1976) qui met en évidence les tannins condensés et la réaction au FeCl3 (Mace, 1963), un colorant pour les phénols en général. Aucune d’elles n’a permis de déterminer la composition exacte de la substance autofluorescencente jaune. Néanmoins, certains résultats intéressants sont apportés par la coloration de Maüle (Gerlach, 1969) qui éteint partiellement cette autofluorescence. Ceci porte à penser que la substance pourrait contenir des phénols associés aux lignines de type syringyl car le test de Maüle permet de colorer ces lignines. Il aurait été souhaitable de tenter d’extraire le composé responsable de cette autofluorescence et de l’analyser par HPLC (chromatographie liquide haute performance) par exemple. Des contraintes de temps et de disponibilité n’ont pas permis de réaliser de tels essais. Et-touil (2000) a lui aussi repéré une autofluorescence ressemblant à celle décrite dans cette étude. L’autofluorescence décrite par Et-touil semble être liée aux réactions de défense de l’orme à une infection par Ophiostoma novo-ulmi . La nature chimique de la ou des substances n’a pu être déterminée dans l’étude d’Et-touil.