| Chapitre 1. Introduction | ||
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| Chapitre 1. Introduction | ||
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Table des matières
Les maladies infectieuses sont responsables de 45 % des décès dans les pays à faibles revenus et de presque une mortalité prématurée sur deux dans le monde entier. Environ 90 % de ces décès peuvent être attribués à six maladies; soit les infections respiratoires aiguës prédominées par la pneumonie, les maladies diarrhéiques, le VIH/SIDA (Virus d’Immunodéficience Humaine/Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise), la tuberculose, le paludisme et la rougeole (Prentice 2000). Les infections bactériennes responsables de la pneumonie, des maladies diarrhéiques et de la tuberculose causent 9 millions de décès sur les 13 millions occasionnés par les maladies infectieuses. Ainsi, les infections bactériennes représentent 70 % des cas de mortalité causés par les microorganismes (Walsh 2003). Selon le NIH (National Institute of Health), les maladies infectieuses représentent la seconde cause de décès et la première cause de perte d’années de vie productives à travers le monde (Fauci 2001). L’importance des infections d’origine bactérienne n’est donc plus à démontrer. De plus, les changements sociaux et technologiques combinés à l’évolution bactérienne favorisent l’émergence de nouveaux pathogènes tel Escherichia coli 0157:H7 ainsi que la réémergence d’infections anciennement contrôlées comme la tuberculose. Les infections bactériennes méritent donc d’attirer l’attention du grand public, des chercheurs académiques, des compagnies pharmaceutiques et du gouvernement (Cohen 2000).
Plusieurs facteurs ont contribué à diminuer l’impact des infections bactériennes et à augmenter l’espérance de vie au cours du 20è siècle tel que résumé par la figure 1. La longue évolution conjointe des bactéries pathogènes et de l’être humain a entraîné une diminution de susceptibilité de l’hôte grâce à la sélection naturelle. Par la suite, la conscientisation de la population a amoindri la transmission via une meilleure hygiène, une alimentation plus sécuritaire et l’aménagement d’organisations sanitaires. Finalement, l’avenue des vaccins et antibiotiques a augmenté l’espérance de vie de 47 à 76 ans de 1900 à 1997 dans les pays développés (Cohen 2000).
Figure 1. Facteurs favorisant le déclin des infections bactériennes au 20è siècle (Cohen 2000).
Suite à cette diminution importante de l’incidence et de la gravité des maladies infectieuses, la recherche sur la prévention et le traitement de ces infections a été dévalorisée. Convaincues de détenir un arsenal suffisant pour éliminer toutes infections, les compagnies pharmaceutiques ont réduit leurs activités de recherche et de développement d’antibiotiques. Les générations suivantes ont sous-estimé le pouvoir évolutif des bactéries pathogènes et ont véhiculé une attitude de négligence et de confiance aveugle envers les antibiotiques. Cela a grandement favorisé l’émergence et la réémergence des infections bactériennes qui évoluent sur l’ensemble de la planète tel que démontré sur la figure 2 (Fauci 2001).
Figure 2. Distributions géographiques des sites d’origine des maladies infectieuses émergentes et réemergentes (Fauci 2001).
Une étude récente relate six facteurs principaux à la source de ce phénomène résumés par la figure 3. L’émergence et la réémergence découlent des changements sociaux et technologiques qui augmentent la susceptibilité des populations et favorisent la transmission des pathogènes. Les changements démographiques incluent des facteurs qui favorisent la transmission des infections tels que l’augmentation des situations familiales précaires qui entraînent de plus grandes charges en garderies, les voyages et l’immigration de populations hautement à risque, les relations sexuelles dangereuses et la prise de drogue par intraveineuse. Ils comprennent également les facteurs augmentant la susceptibilité de la population tel que le vieillissement, la malnutrition ou l’obésité ainsi que l’augmentation de l’incidence des maladies non infectieuses comme le cancer et les maladies auto-immunes. De plus, les avancées technologiques et médicales éliminent le processus de sélection naturelle en permettant aux malades de survivre plus longtemps et de se reproduire. Ainsi, les maladies infectieuses et génétiques se propagent davantage dans une population d’hôtes de plus en plus susceptibles. En fait, les technologies médicales comme la transplantation d’organes et la chimiothérapie créent des conditions propices à l’émergence de nouvelles maladies chez les patients les plus vulnérables. Même les avancées technologiques mineures comme les tampons super absorbants et les chaînes de restauration rapide favorisent l’émergence de pathologies comme le syndrome du choc toxique et la maladie du hamburger. Au point de vue environnemental, les changements climatiques tels que le réchauffement de la planète et le déboisement de la forêt tropicale contribuent grandement à ce phénomène. Finalement, l’évolution des pathogènes bactériens via l’acquisition de nouveaux facteurs de virulence et la résistance aux antibiotiques amplifient grandement l’émergence et la réémergence (Cohen 2000).
Figure 3. Facteurs favorisant l’émergence et la réémergence des infections bactériennes (Cohen 2000).
Ironiquement, des facteurs favorisant le déclin d’une maladie peuvent contribuer à en amplifier une autre et cela rend la problématique extrêmement complexe. Par exemple, l’avènement de la réfrigération a permis d’inhiber la croissance de la majorité des pathogènes alimentaires en augmentant la qualité microbiologique des aliments. Cependant, cela confère un avantage sélectif aux bactéries qui possèdent la capacité de croître à 4°C comme les espèces des genres Listeria et Yersinia (Cohen 2000). De plus, plusieurs maladies chroniques présumées non infectieuses s’avèrent directement ou indirectement liées à des microorganismes pathogènes. Les ulcères et carcinomes gastriques constituent un bon exemple car ils découlent principalement d’une infection à Helicobacter pylori (Fauci 2001). En perspective, les facteurs favorisant l’émergence des infections bactériennes ne vont que s’amplifier dans les prochaines années. Ainsi, il s’avère important de mettre en place des programmes de santé internationaux pour surveiller l’émergence et la réémergence de maladies infectieuses, d’entreprendre des recherches, de raffiner les différents systèmes de santé publique et de développer des stratégies d’intervention afin de diminuer la susceptibilité des populations puis de prôner une utilisation adéquate des antimicrobiens (Cohen 2000). Enfin, la recherche sur les maladies infectieuses devrait occuper une place prédominante au 21è siècle dans les pays développés et en développement. Plus que jamais, la conscience des conséquences reliées aux infections bactériennes sur l’état de santé globale, l’économie, la stabilité politique et le bioterrorisme augmente le support financier accordé aux recherches. Combiné aux récentes avancées technologiques comme le séquençage des génomes humains et bactériens, cela permet d’excellentes opportunités de recherche sur les causes de la prédisposition aux infections, sur la pathogénie bactérienne ainsi que sur le développement de nouvelles stratégies de défense contre les microorganismes (Fauci 2001).
Parmi les maladies infectieuses en émergence et réémergence, les infections bactériennes nosocomiales occupent une place prédominante. Ces infections acquises en milieu hospitalier sont majoritairement causées par des microorganismes opportunistes qui n’affectent pas les hôtes sains mais qui portent préjudice aux hôtes avec un faible système immunitaire. Ce type d’infection se trouve en émergence car le nombre de sidéens, de cancéreux, de transplantés et de personnes âgées augmente. De plus, la majorité de cette population immunodéprimée est hospitalisée et cela favorise les infections opportunistes nosocomiales. Ainsi, les microorganismes opportunistes causent plus d’infections que jamais et ils constituent un sujet de recherche primordial en santé publique (Kaplan, Sepkowitz et al. 2001)
La famille des Pseudomonacées constitue probablement la forme de vie la plus abondante et la plus répandue sur la planète (Pitt 2002). L’espèce P. aeruginosa représente un bon exemple car elle est ubiquitaire et se retrouve principalement dans le sol ainsi que dans l’eau douce et salée. Elle joue un rôle important dans l’écologie du sol et possède une capacité remarquable de dégradation qui en fait un agent de bioremédiation très utile. De plus, certaines souches de P. aeruginosa produisent des composés fongicides et constituent des outils intéressants de biocontrôle pour protéger les végétaux contre les infections à champignons (Galli, Silver et al. 1992). P. aeruginosa se présente sous la forme d’un bâtonnet mobile à gram négatif exprimant un pigment vert nommé pyocyanine comme présenté ci-dessous par la figure 4 (Salyers and Whitt 2002). Il possède un métabolisme oxydatif et il peut croître en conditions anaérobiques en utilisant le nitrate en tant qu’accepteur final d’électrons.
Figure 4. Observation de P. aeruginosa en microscopie confocale (http://www.pseudomonas.com/whos_involved.html).
Le pathogène opportuniste qu’est P. aeruginosa ne cause aucun problème aux organismes bénéficiant d’un bon système immunitaire mais il peut causer une variété d’infections chez les végétaux autant que chez l’humain. Ainsi, il tire avantage des brèches dans l’immunité des personnes immunodéprimées comme les grands brûlés, les personnes âgées ou les nouveau-nés ainsi que les patients atteints de fibrose kystique. P. aeruginosa peut alors engendrer des infections urinaires, oculaires ou pulmonaires et infecter des plaies profondes en entraînant un choc septique. En fait, P. aeruginosa représente l’une des trois plus grandes causes d’infections opportunistes chez l’humain (Stover, Pham et al. 2000). De plus, cette bactérie opportuniste est la principale cause de décès chez les grands brûlés et chez les personnes souffrant de mucoviscidose (fibrose kystique) (Salyers and Whitt 2002). Cette maladie autosomale récessive affecte un nouveau-né sur 2000 chez les Caucasiens et cela en fait la maladie héréditaire létale la plus prévalente. La mucoviscidose est causée par une mutation dans le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) et 70 % des cas découlent d’un changement d’acide aminé en position Phe 508 (May, Shinabarger et al. 1991). Cela occasionne une séquestration de la protéine CFTR au niveau du réticulum endoplasmique et abolit sa fonction biologique de canal à chlore (Goldberg and Pier 2000). Les patients présentent alors un transport anormal d’électrolytes ainsi qu’une sécrétion aberrante de mucus par les glandes exocrines et l’épithélium sécrétoire. La maladie se traduit principalement par une affliction pulmonaire chronique avec une toux persistance et une détresse respiratoire ainsi qu’une insuffisance pancréatique (May, Shinabarger et al. 1991). Plusieurs défauts moléculaires illustrés à la figure 5 expliquent pourquoi P. aeruginosa colonise à vie la majorité des patients et entraîne la mort dans plus de 90 % des cas. Tout d’abord, la production anormale de mucus déshydraté et visqueux abolit la fonction protectrice du mucus et des cils qui évacuent habituellement les microorganismes. De plus, la haute concentration de sels dans le système respiratoire inhibe les peptides antimicrobiens protecteurs. Troisièmement, les cellules épithéliales pulmonaires des patients souffrant de fibrose kystique présentent davantage de récepteurs reconnus spécifiquement par P. aeruginosa et cela favorise son adhérence. De plus, les cellules épithéliales respiratoires normales peuvent ingérer certaines bactéries afin de protéger l’organisme mais les cellules qui ne présentent pas le canal CFTR perdent partiellement la capacité d’ingérer P. aeruginosa . Finalement, le niveau d’expression d’oxyde nitrique et de glutathion est sensiblement plus faible chez les patients et cela affaiblit leur immunité innée (Davies 2002).
Figure 5. Principaux facteurs favorisant la colonisation pulmonaire des patients atteints de fibrose kystique par P. aeruginosa (Davies 2002).
Suite à la colonisation du système respiratoire par P. aeruginosa , l’infection perdure malheureusement jusqu’au décès du patient. Ce pathogène produit des immuno-évasines pour échapper au système immunitaire, il résiste aux antibiotiques puis il change de phénotype afin de persister dans l’hôte (Davies 2002). En effet, la majorité des souches deviennent mucoïdes en produisant de l’alginate puis forment un biofilm. Cela augmente la viscosité du mucus qui obstrue de plus en plus les voies respiratoires. De plus, la capsule d’alginate et le biofilm permettent la persistance chronique de P. aeruginosa car ils empêchent la fixation des anticorps spécifiques, protègent contre la phagocytose et l’opsonisation, inhibent l’attachement des cellules immunitaires, nuisent à la chimiotaxie des leucocytes, favorisent l’adhérence de P. aeruginosa aux cellules épithéliales puis constituent une barrière ionique contre le passage de certains antibiotiques comme les aminoglycosides (May, Shinabarger et al. 1991) À ce jour, aucun traitement efficace n’existe pour enrayer l’infection à P. aeruginosa et les mesures de prévention telle que l’hygiène sont favorisées. Cependant, la majorité des personnes susceptibles reposent étroitement en contact avec P. aeruginosa dans les milieux hospitaliers (Pitt 2002). En effet, la versatilité nutritionnelle de ce pathogène lui permet de survivre jusque dans l’eau distillée et dans du désinfectant en solution (Salyers and Whitt 2002).
L’année 2000 compte parmi ces exploits la fin du séquençage du génome de P. aeruginosa . Le terme employé n’est pas exagéré car ce pathogène possède le plus grand génome bactérien connu avec 6,3 Mpb et un contenu en GC de 66 %. Ce génome impressionnant comprend 5570 cadres de lecture ouverts et renferme la plus haute proportion de gènes régulateurs enregistrée. La complexité génétique de P. aeruginosa rime avec sa capacité d’adaptation car il possède plusieurs gènes de catabolisme, de transport et d’efflux et de chimiotaxie. À titre d’exemple, cette bactérie opportuniste dispose de plus de 300 systèmes de transport de nutriments (Stover, Pham et al. 2000). Le génome code également pour de nombreux systèmes de régulation à deux composantes comprenant 55 protéines kinase détectrices, 89 facteurs de transcription et 14 protéines de fusion détectrices/régulatrices qui confèrent à P. aeruginosa une grande capacité d’intégration de signaux et de réponse aux changements environnementaux. De plus, P. aeruginosa possède un nombre impressionnant de porines et de pompes d’efflux qui lui permettent de maintenir de faibles concentrations d’antibiotiques dans son cytoplasme (Walsh 2003). Finalement, le séquençage complet du génome facilite l’étude des multiples facteurs de virulence tels que les adhésines, le LPS, le système de sécrétion de type III, les toxines ExoS et ExoU, l’élastase et la production d’alginate puis de biofilm (Salyers and Whitt 2002).
La raison principale justifiant le choix de P. aeruginosa en tant que modèle d’étude pour le développement de nouveaux antimicrobiens est l’absence de traitement efficace pour combattre ces infections d’importance considérable en santé humaine. Une deuxième raison réside en la capacité surprenante de P. aeruginosa à résister aux antibiotiques. En effet, ce microorganisme pathogène est naturellement résistant contre la majorité des antibiotiques utilisés à ce jour. De plus, certaines souches de P. aeruginosa ont acquis des mécanismes de résistance exogène et ne répondent à aucun antimicrobien disponible (Salyers and Whitt 2002). Enfin, la production d’alginate combinée aux nombreux systèmes d’efflux actifs et à sa faible perméabilité membranaire en font un véritable champion de la résistance qui mérite d’être étudié (Hancock and Brinkman 2002). Finalement, le génome de ce pathogène est séquencé et cela favorise grandement les recherches dans les domaines de pointe comme la génomique et protéomique (Stover, Pham et al. 2000).
Par définition, un antibiotique consiste en une substance chimique naturelle produite par un microorganisme qui détruit ou inhibe la croissance microbienne spécifiquement à faible concentration. L’historique des antibiotiques débute en 1928 lorsque l’Anglais Alexander Fleming observe des zones de lyses bactériennes autour du célèbre champignon Penicillium notatum . La pénicilline a soulevé un élan d’enthousiasme en ces années de guerre puis l’ère des antibiotiques a supplanté celle de la thérapie phagique. Aujourd’hui, les tablettes de pharmacie regorgent de divers antimicrobiens qui possèdent quatre principales cibles bactériennes représentées à la figure 6. La vancomycine et les antimicrobiens à noyau β-lactame comme la pénicilline attaquent la paroi de peptidoglycan spécifique aux bactéries. Ensuite, les aminoglycosides, la tétracycline, le chloramphénicol et les macrolides bloquent la synthèse protéique. La synthèse d’acides nucléiques quant à elle est inhibée par la rifampicine et les quinolones. Finalement, la voie métabolique de l’acide folique est inefficace sous l’action des sulfamides et du triméthoprime (Franklin and Snow 1989; Axelsen 2002)
Figure 6. Principales cibles des 4 grandes classes d’antimicrobiens (Walsh 2003).
La nature même des antibiotiques répond efficacement à la question suivante : quelle est l’origine des gènes de résistance? Les antibiotiques naturels proviennent de microorganismes de l’environnement tels les champignons et les espèces du genre Streptomyces . Les populations microbiennes environnantes et les espèces productrices d’antibiotiques doivent donc se protéger contre ces molécules destructrices depuis des millions d’années. Ainsi, elles ont développé plusieurs stratégies de résistance favorisées par ce fort facteur de sélection. Par la suite, les transferts de matériel génétique verticaux et horizontaux comme la conjugaison, la transformation et la transduction ont permis la propagation des mécanismes de résistance aux cellules filles puis aux diverses espèces bactériennes.
Il existe deux principales astuces qui permettent aux bactéries d’échapper à l’action des antibiotiques. La résistance génétique compte pour plus de 99 % des cas alors que la résistance non génétique se retrouve plus rarement. Cette forme de résistance comprend l’évasion où un microorganisme persiste dans les tissus hors d’atteinte des antimicrobiens tout en y demeurant sensible. Les bactéries peuvent également adopter une forme transitoire L où elles sont dépourvues d’une grande portion de leur paroi et résistent aux antibiotiques qui ciblent cette dernière. En ce qui concerne la résistance génétique, elle provient d’un changement génétique chromosomique ou extra chromosomique suivi d’une sélection par un antimicrobien. Les modifications chromosomiques découlent de mutations stables qui confèrent rarement un désavantage évolutif. L’ADN polymérase bactérienne introduit une mutation sur 107 paires de base et les foyers infectieux comprennent environ 109 bactéries alors il n’est pas surprenant de voir surgir des clones résistants (Walsh 2003). L’acquisition de matériel génétique sous forme de plasmide, de transposon ou d’intégron compte pour environ 80 % des cas de résistance. Les plasmides transportent souvent plusieurs gènes de résistance et peuvent en acquérir davantage par recombinaison homologue, transposition ou intégration. Les intégrons consistent en des éléments complexes avec leur propre promoteur, intégrase et points de recombinaison homologue pour l’intégration de cassettes avec des gènes de résistance (Normark and Normark 2002).
Les bactéries se défendent contre les grandes classes d’antimicrobiens par trois mécanismes généraux illustrés sur la figure 7. Tout d’abord, elles peuvent modifier ou détruire l’antibiotique à l’aide d’un gène de résistance extra chromosomique. Ce mécanisme agit principalement contre les antimicrobiens naturels comme la pénicilline qui se retrouve dans l’environnement depuis des millions d’années. Le meilleur exemple est l’expression d’enzymes β-lactamases bactériennes qui hydrolysent les antibiotiques à noyau β-lactame. Par contre, ce mécanisme ne contribue pas encore à la résistance contre les antibiotiques synthétiques comme le triméthoprime qui se trouve sur le marché depuis à peine 70 ans. L’absence de réserve de gènes de résistance environnementaux explique ce phénomène (Walsh 2003). Plusieurs espèces bactériennes possèdent des pompes d’efflux qui expulsent activement les antibiotiques à l’extérieur de la cellule. Ce second mécanisme prévient l’accumulation de concentrations thérapeutiques d’antimicrobiens dans le cytoplasme bactérien. Les pompes transmembranaires peuvent être acquises via un plasmide ou un transposon mais elles font souvent partie intégrante de la physiologie bactérienne. Ces dernières exportent des métabolites, des composés toxiques ainsi que des facteurs de virulence comme des toxines. Le cas de P. aeruginosa ne peut être passé sous silence car il possède plus de 72 pompes distinctes qui lui permettent de résister à une multitude d’antibiotiques (Hancock and Brinkman 2002). Finalement, le troisième mécanisme implique une modification ou un remplacement de la cible thérapeutique. Les bactéries peuvent subir une mutation chromosomique qui entraîne une altération de la cible. Ainsi, cette dernière peut devenir insensible à l’action de la drogue tout en conservant son activité biologique. Les espèces naturellement transformables comme Streptococcus pneumoniae acquièrent facilement du matériel génétique de leur environnement et résistent à la pénicilline en empruntant une nouvelle enzyme PLP (Protéine Liant la Pénicilline) insensible à une autre espèce telle Streptococcus mitis (Normark and Normark 2002).
L’évolution et la progression de la résistance bactérienne aux grandes classes d’antibiotiques découlent de quatre principaux facteurs. Tout d’abord, l’utilisation abusive des antimicrobiens a exercé une forte pression sélective sur les populations bactériennes. Ainsi, les antibiotiques ont enclenché le processus de l’évolution en créant un nouveau facteur de sélection naturelle. Les microorganismes possédant des gènes de résistance ou d’évasion face aux molécules destructrices ont été les seuls à survivre et à se multiplier dans les environnements traités. Ainsi, les populations résistantes ont spontanément pris le dessus sur les souches bactériennes sensibles et leur domination s’amplifie au gré de l’utilisation des antibiotiques. Une seconde cause d’évolution de la résistance réside dans la capacité stupéfiante des microorganismes à se propager. La dissémination des grands clones épidémiques tel que les Staphylococcus aureus résistants à la méthycilline (SARM) et les Entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) propagent la problématique à travers le globe (Normark and Normark 2002). De plus, le mode de vie actuel et la croissance démographique combinés aux déplacements à grande vitesse augmentent les contacts humains. En troisième lieu, le vieillissement de la population accompagné de l’augmentation des cas de cancers et de la propagation du VIH accroit considérablement les populations humaines immunodéprimées. Ce phénomène favorise l’émergence d’infections opportunistes causées par des microorganismes de la flore normale tels que P. aeruginosa et S. aureus . Ces derniers subsistent dans le corps humain donc ils se trouvent fréquemment en contact avec des antibiotiques et, par le fait même, sont souvent résistants. Finalement, l’utilisation d’analogues d’antibiotiques employés en médecine humaine dans la supplémentation nutritionnelle animale a favorisée l’avenue d’une résistance croisée pour nos antibiotiques (Witte 1997).
La résistance bactérienne face aux antibiotiques s’avère très préoccupante en ce début de millénaire. En fait, aucune espèce bactérienne connue parmi celles rencontrées en pathologie humaine et aucun antibiotique n’échappent aujourd’hui à ce phénomène. Les mécanismes de résistance les plus anciens se sont répandus parmi les souches bactériennes en s’ajoutant aux nouvelles mutations spontanées pour entraîner une augmentation drastique de la fréquence de résistance en quelques années. Finalement, aucune nouvelle classe d’antibiotiques s’attaquant à une cible bactérienne inédite n’a été commercialisée depuis 30 ans alors aucun échappatoire n’est disponible (Acar 1998). La problématique actuelle de la résistance entraîne plusieurs conséquences néfastes pour l’être humain. En fait, de plus ne plus de malades ne peuvent être traités adéquatement alors ils demeurent infectés plus longtemps et cela les expose davantage au risque de décès. De plus, l’augmentation du phénomène de résistance prolonge et aggrave les épisodes d’épidémie à travers le monde qui propagent encore plus les pathogènes multirésistants. Finalement, il ne faut pas négliger l’emballement des prix des antimicrobiens causé par l’évolution de la résistance. Cela diminue l’accès aux médicaments des populations les plus pauvres et souvent les plus touchées par les infections bactériennes (Prentice 2000). Ainsi, il s’avère crucial de conscientiser la population humaine afin d’apporter des solutions à cette problématique.
Les avenues possibles pour contrebalancer l’évolution de la résistance aux antimicrobiens sont multiples. Tout d’abord, il s’avère primordial d’instaurer une pratique d’utilisation plus prudente des différentes drogues. Pour ce faire, il faudrait encourager l’utilisation d’antibiotiques à spectre étroit suite à l’identification bactérienne, optimiser les doses et durées des traitements afin de diminuer les risques de sélection, établir des tests de diagnostique rapides et efficaces afin d’établir les profils de résistance des pathogènes puis restreindre au maximum l’emploi d’antibiotique. Ensuite, il est important de lutter contre la diffusion des souches bactériennes multirésistantes en prenant soin de détecter de façon précoce les personnes porteuses, de les isoler convenablement, d’établir un réseau mondial d’observation épidémiologique puis de mettre en place des mesures de vaccination et d’hygiène adéquates. Finalement, il s’avère essentiel de développer de nouveaux antimicrobiens. Cela peut être réalisé en criblant des microorganismes, en bloquant les mécanismes de résistance, en exploitant la chimie combinatoire puis en étudiant de nouvelles cibles thérapeutiques (Cunha 2001).
L’histoire des cinquante dernières années démontre que l’usage abusif des antibiotiques mène inévitablement au développement de la résistance. Afin de contrer ce phénomène, la communauté scientifique se doit de développer de nouvelles classes structurales et fonctionnelles d’antimicrobiens et d’en faire une utilisation intelligente. Depuis le début des années 1990, plusieurs stratégies sont mises en œuvre afin de découvrir et de mettre sur le marché de nouveaux antibiotiques. Les méthodes traditionnelles comme le criblage d’antimicrobiens naturels et le blocage des mécanismes de résistance occupent toujours une place importante. Cependant, l’avenue de nouvelles méthodes de chimie combinatoire procure un grand enthousiasme en recherche thérapeutique. En effet, la modification d’antimicrobiens naturels, la synthèse de banques de molécules puis la synthèse d’inhibiteurs sur mesure dominent le marché pharmaceutique. Afin de déjouer le processus de résistance, la recherche doit mener au développement d’antimicrobiens de structure et de fonction nouvelle et, pour ce faire, il faut identifier des cibles bactériennes inédites. Les récentes avancées technologiques en biologie moléculaire, en génomique et en protéomique mettent à jour de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que des méthodes innovatrices de criblage biologique telle la présentation phagique.
Depuis 4,8 milliards d’années, les organismes ont synthétisé bien plus de molécules différentes que les chimistes n’en produiront jamais. Ce principe favorise le criblage de microorganismes à la recherche de métabolites secondaires bactériostatiques ou bactéricides. La stratégie traditionnelle consistait à cribler en continu des cultures microbiennes diversifiées. Après six décennies d’expérimentation, les scientifiques se consacrent maintenant à la recherche de nouveaux gènes de biosynthèse d’antibiotiques parmi les microorganismes non cultivables en laboratoire. La probabilité de dénicher de nouveaux antimicrobiens parmi cette population sous étudiée est élevée car elle représente 99 % de la diversité microbienne (Walsh 2003). La disponibilité de la séquence de plus de 50 génomes microbiens et la bioinformatique favorisent le criblage moléculaire des espèces non cultivables. En effet, plusieurs gènes responsables de la biosynthèse des métabolites secondaires sont caractérisés et cela permet la synthèse d’amorces spécifiques puis le criblage par PCR (Polymerase Chain Reaction). Le séquençage suivi de l’analyse bioinformatique des génomes microbiens peut également constituer une stratégie de criblage moléculaire (Breithaupt 1999).
Les inhibiteurs de β-lactamase inactivent les principales enzymes bactériennes responsables de la résistance aux antibiotiques de type β-lactame. Ces inhibiteurs constituent le premier exemple de blocage d’un mécanisme de résistance bactérienne (Franklin and Snow 1989). Quelques autres avenues d’interférence avec ces mécanismes sont présentement à l’étude. La recherche de composés qui déstabilisent la membrane externe des bactéries à gram négatif est primordiale car de nombreuses espèces résistent aux antibiotiques via une faible perméabilité membranaire. Finalement, plusieurs groupes de recherche tentent de développer des molécules qui déstabilisent les pompes à efflux ainsi que des antimicrobiens qui échappent à leur action (Breithaupt 1999).
La chimie combinatoire permet maintenant la synthèse de milliers de nouvelles molécules à partir d’un antibiotique naturel connu. Ces antimicrobiens modifiés sont ensuite testés sur des bactéries multirésistantes comme P. aeruginosa ou S. aureus résistant à la vancomycine afin de sélectionner les meilleurs candidats thérapeutiques. L’objectif principal des modifications chimiques apportées aux divers antibiotiques naturels consiste à les transformer de telle façon qu’ils ne soient plus reconnus pas les mécanismes de résistance bactériens. Elles visent également à maximiser les propriétés pharmacologiques des antimicrobiens comme leur efficacité, leur stabilité et leur biodisponibilité (Hughes 2003). Cette approche pharmacologique possède un fort potentiel et les quatre générations de céphalosporine (antibiotique à noyau β-lactame) en témoignent (Walsh 2003). Cependant, elle possède un inconvénient majeur qui réside dans l’absence de développement de nouveaux modes d’action moléculaire.
La synthèse de banques de molécules et la synthèse organique sur mesure décrites ci-dessous prennent une ampleur considérable dans la recherche thérapeutique. Cela découle de leur principal avantage qu’est la création de molécules innovatrices au point de vue structural et fonctionnel avec aucun homologue naturel. Cela réduit considérablement les probabilités de réserve de gènes de résistance provenant de l’environnement et minimise les risques de développement de résistance (Walsh 2003). Par contre, cette approche fait face à une problématique de taille : comment trouver les bonnes molécules? La synthèse de banques moléculaires assume que les chimistes peuvent produire une diversité moléculaire suffisante pour atteindre des probabilités favorables de découverte d’antimicrobiens. Cette présomption s’avère réaliste car la discipline révolutionnaire que représente la chimie combinatoire produit rapidement toutes les combinaisons possibles d’un jeu de molécules. (Hughes 2003). La chimie combinatoire peut s’effectuer sur support solide mais la synthèse en milieu liquide gagne de l’intérêt auprès des compagnies pharmaceutiques. En effet, la synthèse sur support solide s’avère beaucoup plus limitante car elle dépend de la formation de liaisons amides donc elle s’applique principalement à la synthèse protéique puis elle requiert plus d’étapes de purification (Geysen, Schoenen et al. 2003). Un exemple de synthèse sur support solide consiste à faire réagir à chaque étape les 20 acides aminés naturels afin d’obtenir en n étapes 20 n peptides différents. La méthode de répartition et de mélange se déroule également sur un support solide constitué de billes de polystyrène. Lorsque ces dernières viennent en contact avec un solvant, elles gonflent et deviennent accessibles aux réactifs dissous. Chaque bille porte environ 1013 amorces qui se combinent aux réactifs pour produire de multiples oligomères (Thompson and Ellman 1996). En ce qui concerne la synthèse en milieu liquide, elle exploite les mêmes mécanismes en utilisant des polymères solubles. La chimie combinatoire dynamique illustrée à la figure 8 est une application qui se réalise en solution. Dans ce cas, la banque de molécules réfère à un nombre limité de groupements de synthèse qui se réarrangent continuellement. Finalement, l’ajout d’une protéine cible favorise la formation de molécules de forte affinité pour cette dernière (Lehn and Eliseev 2001).
Figure 8. Représentation de la chimie combinatoire dynamique (Lehn and Eliseev 2001).
Finalement, les tests de criblage colorimétrique spécifiques décèlent les candidats intéressants qui sont caractérisés. En moyenne, un criblage à haut débit robotisé permet d’analyser entre 100 000 et 500 000 molécules en quelques semaines.
Les progrès de la biologie moléculaire, de la chimie, de la génomique structurale, de la protéomique et de la bioinformatique permettent maintenant une conception rationnelle d’antibiotiques. De plus, la modélisation moléculaire et les études de structure tridimensionnelle réalisées grâce au RMN (Résonance Magnétique Nucléaire), aux rayons X et à la cristallographie permettent d’analyser en profondeur la conformation de protéines bactériennes. Par conséquent, il est possible de cibler correctement la structure moléculaire appropriée afin d’inhiber ces protéines puis d’effectuer la synthèse organique nécessaire. (Hughes 2003). Cependant, la validité de cette stratégie de développement d’antimicrobiens repose entièrement sur le choix éclairé de la cible thérapeutique.
Le séquençage des génomes bactériens combiné à la génomique et à la protéomique permet d’identifier des gènes essentiels à la survie et à la virulence des pathogènes (Breithaupt 1999). Une application importante de la génomique bactérienne est la STM (Signature-Tagged Mutagenesis) qui permet l’identification de gènes essentiels à la survie bactérienne in vivo (Lehoux, Sanschagrin et al. 2002). Finalement, les analyses bioinformatiques révèlent l’identité des protéines essentielles pour la persistance dans l’animal. Cependant, ces dernières doivent répondre à plusieurs critères qui s’ajoutent à l’essentialité avant d’être considérées comme cibles. Ainsi, les protéines doivent être exprimées en quantité appréciable lors de l’infection, être conservées dans l’évolution bactérienne, leur inhibition doit entraîner un phénotype létal puis elles ne doivent pas être conservées chez l’humain. Plusieurs cibles bactériennes ont déjà été sélectionnées tel que montré par la figure 9; soit la machinerie de réplication de l’ADN, la signalisation intracellulaire et intercellulaire, les facteurs de virulence comme les adhésines, la synthèse du LPS, la biosynthèse de la paroi, la division cellulaire, l’ARN polymérase, les mécanismes d’acquisition du fer, la glycosylation puis la biosynthèse des acides gras et de l’acide folique (Breithaupt 1999; Projan 2002; Salyers and Whitt 2002). Parmi ces dernières, notre équipe de recherche s’intéresse particulièrement à la division cellulaire bactérienne.
Figure 9. Quelques exemples de cibles bactériennes (Breithaupt 1999).
La machinerie de division cellulaire s’avère un excellent choix de cible thérapeutique dans l’optique du développement de nouveaux antimicrobiens (Projan 2002). Tout d’abord, il s’agit d’un processus essentiel à la survie bactérienne qui mène à un phénotype létal s’il est inhibé. Le divisosome, qui se définit comme l’ensemble des protéines impliquées dans la division cellulaire, est très conservé dans l’évolution bactérienne mais absent chez l’humain. De plus, le processus de division s’avère extrêmement sensible aux altérations car il implique une cascade précise de protéines ainsi que des ratios critiques. Finalement, aucun antimicrobien connu ne s’attaque spécifiquement à la division cellulaire et cela suggère que les espèces bactériennes n’ont pas encore développé de mécanismes de résistance contre cette classe d’inhibiteurs.
Les avancées technologiques dans les domaines de la cytologie, de la génomique et de la structure protéique ont permis d’approfondir la compréhension de la division cellulaire bactérienne. Ce processus dépend d’une régulation stricte au niveau spatial, temporel et quantitatif qui permet l’invagination des membranes et de la paroi cellulaire coordonnée à la synthèse du peptidoglycan de septation.
L’opéron dcw situé à 2 minutes sur la carte génétique de E. coli regroupe les 16 gènes nécessaires à la division cellulaire et à la synthèse du peptidoglycan de septation (Dai and Lutkenhaus 1992). La majorité des protéines impliquées dans la division portent l’acronyme Fts (Filamentous Temperature Sensitive). Cette appellation date des années 1960-70 au cours desquelles des chercheurs ont identifié des bactéries mutantes filamentant à la température non permissive de 42°C suite à l’inactivation de protéines thermosensibles (Margolin 1999). Ce phénotype illustré à la figure 10 résulte d’une croissance bactérienne continue sans division cellulaire entraînant la formation de longs filaments non viables. Cela fournit la première évidence de l’implication des protéines Fts dans le processus de septation.
Figure 10. Photographies de bactéries viables à 30°C et de bactéries filamenteuses à la température non permissive de 42°C (Pichoff and Lutkenhaus 2002).
La division cellulaire requiert une synthèse accrue de peptidoglycan de septation effectuée par les PLP (Protéines Liant la Pénicilline). Ainsi, les PLP de haut poids moléculaire se chargent des étapes finales de division en formant un septum de peptidoglycan qui se joint aux protéines Fts cytoplasmiques et membranaires afin de traverser la cellule mère pour la séparer physiquement en cellules filles (Nanninga 1998).
La localisation de FtsZ au centre de la cellule initie le processus de division suite à la réplication du génome bactérien. Ainsi, cette protéine se positionne au site de division cellulaire situé entre les nucléoïdes répliqués au début de leur ségrégation. Par la suite, FtsZ polymérise en un anneau de division et recrute les protéines FtsA et ZipA qui stabilisent l’anneau et l’ancre à la membrane plasmique. Ces dernières enclenchent alors un processus de recrutement protéique en cascade illustré à la figure 11 afin de rapatrier toutes les protéines requises à la division de la cellule mère (Errington, Daniel et al. 2003).
Figure 11. Recrutement protéique séquentiel essentiel à la division cellulaire bactérienne (Pichoff and Lutkenhaus 2002).
Le recrutement protéique mène progressivement à l’assemblage du divisosome qui regroupe toutes les protéines requises pour la division cellulaire bactérienne. Suite à la ségrégation des génomes homologues et à la formation du divisosome, l’anneau de division se contracte pour séparer physiquement les cellules filles tel que montré par la figure 12 (Den Blaauwen, Buddelmeijer et al. 1999).
Figure 12. Représentation dynamique du divisosome bactérien et de la constriction de l’anneau de division.
La division cellulaire ne peut être complétée sans une insertion massive de peptidoglycan sous la forme de triplets au site de septation. Cette addition simultanée de triplets de peptidoglycan combinée à la pression osmotique et à la tension de surface fragilise la paroi bactérienne et engendre un site d’invagination continuellement tiré par le divisosome. (Nanninga 1998). Suite à la septation de la cellule mère, l’anneau FtsZ dépolymérise puis les nouveaux anneaux se forment aux sites de division cellulaire des cellules filles qui sont déjà déterminés dans la cellule mère. Chez Deinococcus radiodurans , les sites de division des cellules filles commencent même à se préciser avant celui de la cellule mère (Margolin 1999)!
La première protéine de division cellulaire bactérienne identifiée se révèle être FtsZ. Cette protéine cytoplasmique de 394 acides aminés possédant un poids moléculaire de 40 KDa joue un rôle essentiel et prédominant dans le processus de division.
L’homologue structural de la tubuline que constitue FtsZ s’avère la protéine bactérienne la plus conservée dans l’évolution. Ainsi, toutes les espèces d’eubactéries et d’archéobactéries en possèdent un analogue à l’exception de Clamydia trachomatis et des mitochondries. La structure tridimensionnelle de FtsZ ressemble de près à celle de la tubuline mais ces protéines possèdent seulement 15 % d’homologie au niveau de la séquence en acides aminés. Les études phylogénétiques suggèrent que FtsZ est l’ancêtre moléculaire de la tubuline (van den Ent, Amos et al. 2001). En fait, les archéobactéries et Rhizobium meliloti détiennent une copie non essentielle du gène ftsz qui résulte d’un phénomène de duplication. Cette seconde copie a subi une série de mutations afin de diverger en tubuline qui forme aujourd’hui les microtubules du cytosquelette eucaryote (Margolin 1999).
La structure cristalline de FtsZ de Methanococcus jannaschii a été résolue à 2.8 Angström tel que démontré par la figure 13. Le domaine C-terminal de cette protéine comprend 4 feuillets β supportés par 2 hélices α centrales. Quant au domaine N-terminal, il contient un feuillet β nécessaire à l’activité enzymatique de FtsZ. La portion centrale de la protéine renferme le site de fixation du GTP et comporte 4 boucles qui lient le phosphate ainsi qu’une cinquième qui se joint à l’hélice centrale afin de fixer la guanine (Lowe and Amos 1998).
Figure 13. Structure cristalline de FtsZ de Methanococcus jannaschii résolue à 2.8 Angström illustrant la conformation de FtsZ; les tubes rouges représentent les hélices α alors que les feuillets β sont en jaune et les boucles en vert, le site actif referme l’ATP et le cofacteur magnésium schématisés au centre de la figure. (Lowe and Amos 1998).
La protéine FtsZ possède une activité enzymatique GTPase très bien caractérisée. Il est démontré que l’hydrolyse du GTP s’effectue une minute après la fixation du substrat et qu’une molécule de FtsZ hydrolyse 5 molécules de GTP en GDP par minute in vitro (Stricker, Maddox et al. 2002). De plus, la population de FtsZ retrouvée dans une cellule bactérienne renferme seulement une portion de molécules actives biochimiquement (Romberg, Simon et al. 2001). L’activité GTPase de FtsZ est étroitement liée à sa polymérisation. En effet, l’activité enzymatique est activée par la boucle T7 d’un monomère de FtsZ qui s’insère dans le site de fixation du GTP d’un monomère adjacent suite à la polymérisation. Après l’hydrolyse du GTP, le phosphate inorganique se retrouve séquestré dans la protéine avant d’être relâché (Errington, Daniel et al. 2003).
L’enzyme FtsZ doit se positionner au centre de la cellule afin d’amorcer le processus de division. Deux principaux mécanismes contrôlent cette localisation : l’occlusion du nucléoïde et le système MinCDE. Les protéines Min régulent de façon spatiale la division cellulaire en inhibant la formation de l’anneau FtsZ aux pôles bactériens et en restreignant la formation de l’anneau exclusivement au centre de la cellule. MinC constitue un inhibiteur spécifique de FtsZ qui déstabilise les polymères en empêchant la polymérisation de l’anneau. Quant à la protéine MinD, il s’agit d’une enzyme ATPase qui séquestre MinC à la membrane tout en l’activant. Finalement, la protéine MinE dirige le complexe inhibiteur MinCD vers les pôles afin que le centre de la cellule demeure exempt d’inhibiteur de FtsZ (Pichoff and Lutkenhaus 2001). En pratique, le complexe MinCD oscille d’un pôle à l’autre dans un cycle d’environ 20 secondes et il est inhibiteur seulement quand MinD fixe l’ATP. Lorsque MinCD rencontre MinE qui forme un anneau au centre de la cellule, MinE active l’activité ATPase de MinD qui se décroche de la membrane et relâche MinC qui n’est alors plus inhibiteur. Le cycle recommence lorsque le complexe inhibiteur MinCD se reforme suite à la fixation de l’ATP par MinD (Errington, Daniel et al. 2003). Ainsi, l’anneau MinE oscille au centre de la cellule afin d’éviter la présence du complexe inhibiteur MinCD au site de division tel qu’illustré à la figure 14 (Lackner, Raskin et al. 2003).
Figure 14. Sélection du site de formation du septum par le système MinCDE (www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/MinC%20&%20MinD/MinCDE.pict.jpg).
L’occlusion du nucléoïde fournit un signal temporel et spatial qui régule la division cellulaire bactérienne afin de prévenir la formation de l’anneau FtsZ avant la ségrégation des génomes (Margolin 1999). Ce mécanisme fait appel au génome bactérien en réplication ou nucléoïde qui agit comme une barrière physique contre la division cellulaire en inhibant la formation de l’anneau. Il existe seulement 3 endroits où la concentration du nucléoïde permet la formation de l’anneau ; les pôles où le système MinCDE inhibe la polymérisation de FtsZ et le centre de la cellule qui devient disponible uniquement à la fin de la réplication et vers le milieu de la ségrégation (Errington, Daniel et al. 2003). L’explication de ce phénomène réside dans le fait que la réplication du génome et la biosynthèse de la paroi de peptidoglycan prennent leurs nucléotides pyrimidines de la même réserve cellulaire. Ainsi, la compétition pour les nucléotides ne permet pas la synthèse accrue de peptidoglycan nécessaire à la division cellulaire près du nucléoïde condensé. Lorsque la ségrégation des génomes homologues débute, la synthèse de peptidoglycan est favorisée au centre de la cellule exempt de nucléoïde et cela soutient la formation de l’anneau FtsZ à l’endroit et au moment opportun (Nanninga 1998; Den Blaauwen, Buddelmeijer et al. 1999).
La polymérisation de FtsZ au centre de la cellule engendre la formation d’un anneau de 6 à 7 filaments d’épaisseur. La portion N-terminale de FtsZ permet la polymérisation et la localisation de l’anneau alors que le C-terminal est crucial pour sa morphologie et sa stabilité (Ma, Ehrhardt et al. 1996). Au cours de la division cellulaire, environ 30 % des molécules de FtsZ polymérisent et une réserve considérable demeure disponible. La polymérisation s’avère très rapide et elle se réalise en environ 10 secondes à 28°C. De plus, l’anneau est de nature extrêmement dynamique et il possède une demi-vie de 30 secondes (Stricker, Maddox et al. 2002). Quelques chercheurs affirment que l’hydrolyse du GTP est requise pour la polymérisation de FtsZ (Scheffers and Driessen 2002). Cependant, la majorité des auteurs s’entendent sur la fait que FtsZ polymérise lorsqu’il fixe le GTP et qu’il dépolymérise suite à l’hydrolyse du GTP en GDP (Lutkenhaus and Addinall 1997; Romberg, Simon et al. 2001; Stricker, Maddox et al. 2002; Errington, Daniel et al. 2003). Tel que mentionné précédemment, la polymérisation de FtsZ favorise l’hydrolyse du GTP qui dépend de l’interaction de la boucle T7 d’un monomère avec le site de fixation du GTP du monomère adjacent (Scheffers, de Wit et al. 2002). Ainsi, l’hydrolyse du GTP et la liaison subséquente au GDP et au phosphate inorganique déstabilisent les polymères suite au changement de conformation occasionné. D’ailleurs, la stabilité de l’anneau dépend de la liaison au GTP et les polymères sont grandement consolidés par l’ajout de GTP non hydrolysable. De plus, les polymères de FtsZ se désassemblent instantanément en présence de GDP (Errington, Daniel et al. 2003). Finalement, une bonne corrélation unit l’échange des monomères de l’anneau avec les monomères libres du cytoplasme et l’activité GTPase (Errington, Daniel et al. 2003). En ce qui concerne le mécanisme de polymérisation, la protéine FtsZ fait exception à la règle. En effet, elle représente le seul exemple de polymérisation isodesmique où la concentration critique n’entre pas en jeu et l’initiation de la polymérisation se fait rapidement tel que montré par la figure 15. La majorité des polymères biologiques comme l’actine et la tubuline polymérisent selon le modèle coopératif en formant des polymères très stables au centre qui se remanient continuellement aux extrémités. Quant aux polymères de FtsZ, ils présentent de fortes liaisons longitudinales et de faibles interactions latérales (Romberg, Simon et al. 2001).
Figure 15 Représentation des modèles de polymérisation (A) coopératif et (B) isodesmique (Romberg, Simon et al. 2001).
Suite à la polymérisation de FtsZ et à l’assemblement du divisosome, l’anneau FtsZ se contracte afin de diviser la cellule mère tel qu’illustré à la figure 16. La nature de la force de constriction de l’anneau FtsZ est encore méconnue à ce jour. Cependant, la littérature scientifique expose 2 hypothèses; soit la force de constriction surmonte l’activité constante de l’anneau ou le réarrangement de l’anneau fait partie intégrante de la force. La première hypothèse implique qu’une protéine telle que FtsA fournisse l’énergie nécessaire à la constriction de l’anneau. Quant à l’hypothèse suggérant un réarrangement de l’anneau, elle regroupe 3 différents modèles. Tout d’abord, la dynamique même de l’anneau pourrait être à la base de sa constriction si la perte de molécules de FtsZ surpasse le gain. Ce modèle dépend de l’activité enzymatique de FtsZ car la relâche de molécules de l’anneau est couplée et proportionnelle à son activité GTPase (Stricker, Maddox et al. 2002). Cela est soutenu par le fait qu’une surproduction de FtsZ inhibe la constriction de l’anneau et que ce dernier dépolymérise complètement à la fin de la constriction (Den Blaauwen, Buddelmeijer et al. 1999; Errington, Daniel et al. 2003). Un second modèle suggère que la constriction découle d’un glissement des polymères de FtsZ qui réduirait la circonférence de l’anneau. Le troisième modèle implique un repliement des filaments de FtsZ suite au changement de conformation des monomères occasionné par l’hydrolyse du GTP (Errington, Daniel et al. 2003).
Figure 16. Représentation schématique de la polymérisation et de la constriction de l’anneau FtsZ (Lutkenhaus and Addinall 1997).
Il existe plusieurs inhibiteurs cellulaires endogènes de FtsZ dont SulA et MinC. SulA empêche la localisation cellulaire et la formation de l’anneau en bloquant spécifiquement la polymérisation et l’activité GTPase de FtsZ lorsque l’ADN bactérien est endommagé. Ce système SOS prévient la division cellulaire et la propagation des génomes altérés chez les souches bactériennes RecA- qui ne possèdent pas de machinerie de réparation d’ADN (Lutkenhaus and Addinall 1997). L’inhibiteur endogène MinC décrit dans la section portant sur la localisation cellulaire déstabilise les polymères en empêchant la formation de l’anneau (Pichoff and Lutkenhaus 2001). En fait, MinC prévient la polymérisation de FtsZ et sa colocalisation avec la protéine ZipA (Errington, Daniel et al. 2003).
La protéine cytoplasmique FtsA joue un rôle essentiel mais encore nébuleux dans le processus de division cellulaire bactérien. Cette protéine de 417 acides aminés et 42,6 KDa s’avère beaucoup moins bien caractérisée que FtsZ mais elle n’en est pas pour autant moins intéressante.
La protéine de division cellulaire FtsA est la plus conservée après FtsZ et elle se retrouve dans presque toutes les espèces bactériennes caractérisées à ce jour à l’exception des archéobactéries. FtsA montre une forte homologie structurale avec l’actine et elle appartient à la famille de protéines liant l’ATP regroupant également l’actine, Hsp70 et les kinases des sucres (Feucht, Lucet et al. 2001). Les études phylogénétiques suggèrent que FtsA et l’actine découlent de l’évolution d’un ancêtre commun suite à une duplication et une fusion de gènes (van den Ent, Amos et al. 2001).
La structure cristalline de la protéine FtsA de Thermotoga maritima a récemment été résolue. Cette protéine est constituée de 2 domaines distincts réunis par un inter domaine liant l’ATP (van den Ent and Lowe 2000). La figure 17 illustre la conformation des deux domaines et du site actif de l’enzyme situé dans l’inter domaine.
Figure 17. Structure cristalline de FtsA de Thermotoga maritima résolue à 1.9 Angström; les tubes rouges représentent les hélices α alors que les feuillets β apparaissent en jaune et les boucles en vert, le site actif présent au centre de la figure renferme l’ATP représenté par la molécule grise ainsi que le cofacteur magnésium schématisé par la sphère mauve (van den Ent and Lowe 2000).
La caractérisation biochimique de FtsA révèle la présence d’un site liant et hydrolysant l’ATP (Adénosine Tri-Phosphate). FtsA possède une forte affinité pour l’ATP et une faible affinité pour l’ADP (Adénosine Di-Phosphate) et le GTP. De plus, la présence du cofacteur Mg2+ s’avère essentielle pour l’activité ATPase de FtsA in vitro (Feucht, Lucet et al. 2001)
La localisation de FtsA dans le divisosome dépend uniquement de FtsZ et elle suit de près la formation de l’anneau (Pichoff and Lutkenhaus 2002). De plus, il a été démontré que le résidu conservé Trp 415 de FtsA s’avère essentiel pour sa localisation (Yim, Vandenbussche et al. 2000). Finalement, le positionnement de FtsA est indépendant de la fixation et de l’hydrolyse de l’ATP mais il dépend autant des portions N et C-terminales ainsi que de l’inter domaine (Ma, Ehrhardt et al. 1996).
L’anneau de division FtsZ peut se former sans FtsA mais il ne peut se contracter afin de séparer physiquement la cellule mère (Begg, Nikolaichik et al. 1998). Ainsi, le rôle de stabilisation de l’anneau de FtsA s’avère essentiel au déroulement de la division cellulaire bactérienne. Une hypothèse suggère que FtsA pourrait consolider l’anneau en inhibant l’activité GTPase de FtsZ requise pour la dépolymérisation (Romberg, Simon et al. 2001).
Les preuves appuyant la présence d’une interaction entre FtsA et PLP3 s’accumulent dans la littérature. La protéine membranaire PLP3 possède une activité transpeptidase et transglycosidase essentielle à la synthèse du peptidoglycan de septation. Les archéobactéries ne possèdent pas de peptidoglycan ni de protéine FtsA et cela renforcit le lien entre ces 2 protéines (Nanninga 1998). De plus, une mutation spécifique de FtsA affecte la capacité de PLP3 à lier l’ampicilline puis la surexpression de FtsA provoque une accumulation de peptidoglycan intracellulaire. Finalement, FtsA s’avère essentielle au recrutement et à la localisation de PLP3 (Weiss, Chen et al. 1999). Une hypothèse suggère que FtsA assume le lien entre FtsZ et PLP3 afin de coordonner la polymérisation et la constriction de l’anneau avec la synthèse de peptidoglycan (Dai and Lutkenhaus 1992).
Plusieurs auteurs suggèrent que FtsA pourrait jouer le rôle de protéine motrice en agissant sur FtsZ afin de rapprocher les unités de divisosome au cours de la septation (Nanninga 1998; Feucht, Lucet et al. 2001; Errington, Daniel et al. 2003). Cette hypothèse s’avère des plus plausibles car FtsA possède une activité enzymatique ATPase pouvant fournir l’énergie nécessaire à la constriction cellulaire. De plus, FtsA montre une forte homologie structurale avec l’actine qui consiste en une protéine motrice eucaryote. Chez B. subtilis , le nombre de molécules de FtsA s’avère suffisant pour la formation d’un anneau constricteur (Feucht, Lucet et al. 2001). Finalement, une autre évidence provient du fait que l’anneau FtsZ ne peut pas se contracter sans la présence de FtsA (Begg, Nikolaichik et al. 1998).
Les protéines FtsZ et FtsA interagissent étroitement et spécifiquement ensemble afin de mener à bien le processus de division cellulaire. Cette interaction s’avère particulièrement intéressante en tant que cible thérapeutique et elle inspire de nombreuses recherches.
Une expérience clé démontre que le ratio cellulaire FtsZ :FtsA est critique pour la division cellulaire. L’équipe du Dr Lutkenhaus a tout d’abord montré que la surproduction de FtsZ altère le processus de division en entraînant la production de mini cellules non viables (Dai and Lutkenhaus 1992). Par la suite, ce groupe de recherche a prouvé que la fonction de la protéine FtsZ est affectée lorsqu’elle se retrouve en surplus par rapport à FtsA. Ainsi, une surproduction équivalente de FtsA rétablit la division cellulaire en restituant le ratio moléculaire adéquat. L’analyse du nombre de FtsZ et de FtsA par immunobuvardage quantitatif indique que chaque cellule de E. coli renferme 20 000 molécules de FtsZ et 200 molécules de FtsA. Le ratio de 100 pour 1 se maintient grâce à une régulation stricte qui dépend de l’efficacité différentielle de trois RBS (Ribosome Binding Site) et d’un promoteur additionnel pour ftsZ (Dai and Lutkenhaus 1992). Chez B. subtilis , le ratio FtsZ :FtsA se chiffre à 5 pour 1 et chaque cellule contient 1000 molécules de FtsA. Ainsi, la formation d’un anneau FtsA s’avère possible chez B. subtilis mais improbable chez E. coli étant donné le faible nombre de molécules de FtsA (Feucht, Lucet et al. 2001). La formation d’un tel anneau est d’ailleurs appuyée par l’interaction FtsA-FtsA médiée par la région C-terminale de cette protéine (Yim, Vandenbussche et al. 2000). Les hypothèses élaborées afin d’expliquer la différence de ratio s’appuient sur les divergences fondamentales entre les bactéries à gram négatif tel E. coli et à gram positif comme B. subtilis . Ainsi, le ratio élevé retrouvé chez les bactéries à gram positif pourrait compenser l’absence de ZipA. En effet, les fonctions biologiques de FtsA et de ZipA se recoupent car elles recrutent toutes deux FtsK au site de division et l’anneau FtsZ peut se former avec seulement FtsA ou ZipA (Pichoff and Lutkenhaus 2002). De plus, il a récemment été démontré qu’une seule mutation dans FtsA élimine le besoin de ZipA chez les bactéries à Gram négatif (Geissler, Elraheb et al. 2003). Finalement, les bactéries à Gram positif possèdent davantage de peptidoglycan tel que montré par la figure 18 et elles subissent une pression osmotique interne supérieure aux bactéries à Gram négatif; leur division cellulaire demande donc plus d’énergie. Ainsi, le plus grand nombre de molécules de FtsA chez les bactéries à Gram positif répond peut-être à un besoin supérieur en hydrolyse d’ATP (Feucht, Lucet et al. 2001).
Figure 18. Structure de la paroi des bactéries (A) à Gram négatif composée d’une membrane interne et d’une menbrane externe séparées par une mince couche de peptidoglycan et (B) à Gram positif constituée d’une membrane interne et d’une épaisse couche de peptidoglycan (uct.ac.za/depts/mmi/lsteyn/gramneg.gif&imgrefurl=http://www. uct.ac.za/depts/mmi/lsteyn/cellwall.html).
L’interaction entre FtsZ et FtsA a été confirmée par le système de Yeast Two-hybrid ainsi que par microscopie électronique chez E. coli , B. subtilis , S. aureus , Caulobacter crescentus , R. meliloti et Agrobacterium tumefaciens (Feucht, Lucet et al. 2001). Les études phylogénétiques démontrent que l’interaction directe et spécifique entre FtsA et FtsZ est conservée dans l’évolution bactérienne. De plus, ces protéines semblent évoluer ensemble et elles sont cotranscrites dans les génomes bactériens (Ma, Sun et al. 1997). Une hypothèse suppose que FtsZ pourrait engendrer un changement de conformation qui favoriserait l’activité enzymatique ATPase de FtsA requise pour la constriction de l’anneau (van den Ent and Lowe 2000). Enfin, l’interaction FtsZ-FtsA s’entoure encore de mystère mais il ne fait plus aucun doute qu’elle est essentielle à la division cellulaire (Yan, Pearce et al. 2000).
FtsA interagit avec les 70 derniers acides aminés de la région C-terminale de FtsZ (Haney, Glasfeld et al. 2001). Cette région de FtsZ renferme 8 à 10 acides aminés hautement conservés chez la majorité des espèces bactériennes à l’exception des archéobactéries qui ne détiennent pas d’analogue de FtsA. Le résidu Phe 376 s’avère particulièrement important mais il est possible que FtsA interagisse également avec une autre portion de FtsZ et que la structure tridimensionnelle de FtsA soit requise pour l’interaction (Ma, Ehrhardt et al. 1996; Yan, Pearce et al. 2000). Finalement, la portion C-terminale de FtsZ nuit à sa polymérisation et il se pourrait que la liaison de FtsA au C-terminal de FtsZ favorise la polymérisation.
FtsZ s’avère un excellent choix de cible car il s’agit de la protéine la plus importante pour la division cellulaire. En effet, elle se retrouve en haut de la hiérarchie du recrutement protéique et elle forme l’anneau de constriction. FtsZ est la protéine bactérienne la plus conservée dans l’évolution et des mutations dans cette dernière entraînent un phénotype létal (Errington, Daniel et al. 2003). Finalement, l’activité enzymatique quantifiable de FtsZ peut être exploitée afin de cribler des inhibiteurs. FtsA constitue également une bonne cible thérapeutique car elle est conservée puis essentielle pour la constriction de l’anneau et pour le recrutement protéique. Finalement, l’insertion de mutations dans FtsA mène à un phénotype létal et l’activité ATPase de cette enzyme permet de cribler de potentiels inhibiteurs. De plus, l’interaction FtsZ-FtsA représente une cible intéressante car elle est essentielle puis elle possède un avantage considérable par rapport à l’activité enzymatique protéique. En fait, une inhibition de 50 % de cette interaction bloque la division alors que la majorité des protéines peuvent remplir leur fonction biologique avec une inhibition de 95 %. FtsZ et FtsA échappent cependant à la règle car une inhibition de 50 % d’une de ces protéines débalance leur ratio et inhibe la division. L’interaction FtsZ-FtsA demeure une cible avantageuse car elle est extrêmement sensible et elle est beaucoup plus spécifique qu’une enzyme GTPase ou ATPase (Haney, Glasfeld et al. 2001). Le désavantage majeur des ces cibles cytoplasmiques réside dans le fait que les inhibiteurs potentiels doivent pénétrer les membranes et la paroi bactérienne afin de les atteindre.
La recherche conventionnelle de nouveaux antimicrobiens constitue un processus laborieux et de longue allène. L’exploration de la diversité génétique via la technique de présentation phagique permet quant à elle une sélection rapide et efficace de petits ligands peptidiques interagissant avec une cible thérapeutique déterminée.
Figure 19. Schéma expérimental de la présentation phagique.
Figure 19. Schéma expérimental de la présentation phagique.
Figure 19. Schéma expérimental de la présentation phagique.
Figure 19. Schéma expérimental de la présentation phagique.
La présentation phagique réfère à un criblage moléculaire de banques de bactériophages M13. Ces dernières renferment 1000 copies de chacune des 109 combinaisons peptidiques distinctes fusionnées à la protéine mineure pIII du phage qui se présentent sous la forme de 12-mer, de 7-mer ou de C7C (7 acides aminés flanqués de 2 cystéines). La protéine pIII se retrouve en 5 copies à la surface de la capside du phage et elle permet l’adhésion au pili sexuel de E. coli requise pour l’infection (Hoess 2001). La spécificité de la technique est maximisée par les 3 rondes de biocriblage au cours desquelles la rigueur des lavages augmente puis le temps de contact entre les phages et la protéine d’intérêt diminue (Kay, Kasanov et al. 2001). La figure 19 illustre le principe des 3 rondes où les phages adhérés à la protéine cible sont élués avec de la glycine à pH acide puis de façon compétitive.
Figure 19. Schéma expérimental de la présentation phagique.
La figure 20 décrit une ronde typique de biocriblage où les différentes banques de phages sont mises en contact avec la protéine cible fixée dans le fond d’un puits. Par la suite, les lavages éliminent les bactériophages non spécifiques et l’élution permet de récolter les phages adsorbés à la protéine. Finalement, les phages sélectionnés subissent une amplification afin de constituer le matériel de départ nécessaire pour amorcer une seconde ronde (Kay, Kasanov et al. 2001)
Figure 20. Représentation schématique d’une ronde de biocriblage.
Suite à l’élution des phages spécifiques de la dernière ronde de biocriblage, l’ADN phagique de 10 à 20 phages purifiés est séquencé puis les analyses bioinformatiques identifient les peptides sélectionnés ainsi que les consensus peptidiques.
L’avantage majeur de la présentation phagique réside dans la diversité moléculaire qui permet l’identification rapide et efficace de peptides spécifiques pour une cible d’intérêt pharmacologique (Peczuh and Hamilton 2000). De plus, la construction de banque de phages spécialisées, de banques d’anticorps et d’ADN complémentaires repousse les limites et permet l’identification de ligands peptidiques pour n’importe quelle protéine (Sidhu 2000). Cependant, la présentation phagique comporte certains désavantages qui méritent une attention particulière. Tout d’abord, les élutions ne permettent pas de décrocher tous les phages adsorbés à la surface des protéines et les phages les plus affins et intéressants y demeurent fixés. Deuxièmement, les diverses fusions peptidiques peuvent altérer le pouvoir réplicatif ou infectieux des phages et cela peut biaiser les résultats. Finalement, les banques de phages ne renferment pas toutes les combinaisons peptidiques possibles et quelques acides aminés s’y trouvent sous représentés (Hoess 2001).
Il a été démontré que la majorité des peptides sélectionnés par présentation phagique se lient aux régions d’importance biologique présentes sur la protéine d’intérêt. Ainsi, la plupart des peptides identifiés constituent des inhibiteurs spécifiques des protéines cibles (Hoess 2001). Cependant, les peptides inhibiteurs traînent une mauvaise réputation car ils possèdent une faible demi-vie puis ils se distribuent difficilement dans les tissus. Par contre, les bactéries, les champignons, les végétaux ainsi que les eucaryotes produisent des peptides antimicrobiens en guise de première ligne de défense. Par exemple, les défensines humaines font partie intégrante de l’immunité innée et jouent un rôle important au niveau des défenses des muqueuses (Zasloff 2002). Ces peptides cationiques linéaires proviennent de la dégradation protéolytique d’un précurseur et agissent en déstabilisant les membranes microbiennes. Ce mode d’action n’encourage pas la résistance microbienne qui ne s’est pas encore amorcée et cela contribue à la vague d’intérêt envers les peptides inhibiteurs (Breithaupt 1999; Zasloff 2002). Ainsi, les peptides sélectionnés par présentation phagique sont dignes d’intérêt et il convient de les façonner afin de maximiser leurs propriétés biochimiques et pharmacologiques.
Les modifications chimiques apportées aux peptides incluent la cyclisation, l’ajout de liaisons esters ou de noyaux d’acides gras et de sucres aminés qui peuvent accroître leur stabilité, leur liposolubilité ainsi que leur pouvoir inhibiteur. De plus, le remplacement par des acides aminés inhabituels ou de configuration D et l’ajout de prolines contribuent grandement à la résistance des peptides contre la dégradation protéolytique. Plusieurs peptides antimicrobiens riches en proline isolés chez les insectes empruntent les systèmes de pompes d’import bactériens pour atteindre le cytoplasme alors l’ajout de prolines pourrait également contribuer à la pénétration cytoplasmique des peptides (Walsh 2003). Finalement, l’attribution de charges positives aux peptides sélectionnés peut s’avérer extrêmement avantageuse. En effet, les peptides cationiques s’associent aux membranes microbiennes chargées négativement et ils se lient au site de fixation cationique du LPS. Ils migrent ensuite à travers la paroi de peptidoglycan puis traversent directement la membrane plasmique ou se regroupent sous forme de micelles en formant des canaux qui déstabilisent les membranes. De plus, les peptides cationiques détiennent une spécificité pour les membranes procaryotes qui ne renferment pas de cholestérol et qui présentent des lipides chargés négativement. Ainsi, le gradient électrochimique de ces membranes se distingue du gradient des membranes eucaryotes qui comprennent du cholestérol et des lipides neutres (Zasloff 2002). Finalement, il a été démontré que l’ajout d’un lien carbamate augmente la spécificité des peptides pour les membranes bactériennes tout en diminuant les effets néfastes sur les cellules eucaryotes (Lee and Oh 2000). D’autre part, le peptidomimétisme peut mettre à jour de nouvelles molécules pharmacologiques en imitant la structure et le mode d’action des peptides inhibiteurs. Le peptidomimétisme de base réfère à la synthèse organique de petites molécules qui miment la structure tridimensionnelle des peptides ou de fragments de peptides. Cela permet de conserver ou même d’améliorer le pouvoir inhibiteur des peptides tout en éliminant la problématique de la demi-vie et de la biodisponibilité (Nefzi, Dooley et al. 1998). Quant à l’imitation du mode d’action des peptides, cela requiert de multiples études préliminaires telles que la co-cristallographie de la cible moléculaire et du peptide inhibiteur ainsi que la modélisation informatique. La connaissance approfondie du mode d’action du peptide et des liaisons moléculaires impliquées permet alors d’orienter la synthèse correctement. En perspective, les peptides isolés par présentation phagique peuvent également servir de ligand dans des essais de criblage par compétition afin d’identifier de petites molécules organiques possédant une affinité supérieure (Christensen, Gottlin et al. 2001).
La recrudescence des infections bactériennes et l’occurrence de la résistance accrue contre la plupart des agents antimicrobiens engendrent un besoin urgent de nouvelles classes d’antibiotiques. De plus, le cas du pathogène opportuniste P. aeruginosa doit être pris en considération car il regorge de mécanismes de résistance puis il engendre de multiples infections intraitables et mortelles.
Le programme de recherche proposé vise au développement accéléré d’antimicrobiens contre de nouvelles cibles bactériennes. Ainsi, nous exploitons la machinerie de division cellulaire procaryote en tant que cible. Plus particulièrement, les protéines essentielles FtsZ et FtsA représentent de nouvelles cibles thérapeutiques identifiées par génomique bactérienne et par des analyses récentes du laboratoire. L’hypothèse soutenue suggère que des inhibiteurs de l’activité enzymatique de FtsZ et de FtsA bloqueront spécifiquement la division cellulaire bactérienne en engendrant un phénotype létal. En guise d’objectifs, le criblage des protéines FtsZ et FtsA de P. aeruginosa par présentation phagique devrait mener à l’identification de peptides inhibiteurs qui seront caractérisés biochimiquement et structuralement. Ce programme de recherche devrait donc mener au développement des premiers agents antimicrobiens inhibant la division cellulaire bactérienne tout en apportant de nouvelles connaissances fondamentales sur le processus de division.
Les gènes ftsA et ftsZ de P. aeruginosa ont tout d’abord été clonés dans le vecteur d’expression pET30a et fusionnés avec une étiquette histidine puis les protéines ont été surexprimées chez E coli BL21 (λDE3). FtsZ a été purifiée par chromatographie d’affinité au nickel alors que FtsA a été renaturée suite à la solubilisation des corps d’inclusion purifiés. L’identité et l’activité biochimique respectives de ces protéines ont été confirmées par séquençage en N-terminal puis par essais enzymatiques sur CCM (Chromatographie sur Couche Mince). Ensuite, le criblage des banques de bactériophages M13 12-mer et C7C a été effectué avec les 2 enzymes actives. Les phages adhérés à FtsZ ont été élués avec de la glycine à pH acide puis de façon compétitive avec le substrat de l’enzyme, un analogue non hydrolysable du substrat ainsi qu’avec FtsA. En ce qui concerne les phages adsorbés à FtsA, ils ont été élués avec de la glycine à pH acide puis de façon compétitive avec le substrat de l’enzyme, un analogue non hydrolysable du substrat ainsi qu’avec FtsZ. Enfin, l’ADN a été extrait des phages et les peptides correspondants ont été identifiés. La spécificité de l’interaction entre les peptides sélectionnés et FtsA ou FtsZ a été analysée par ELISA. Les consensus peptidiques identifiés contre FtsZ par présentation phagique ont été synthétisés, leur activité inhibitrice a été caractérisée et leur CI50 (Concentration Inhibitrice de 50 % de l’activité enzymatique de l’enzyme) a été déterminée par CCM. Finalement, les peptides démontrant la plus grande affinité pour FtsA ont également été synthétisés et leur caractérisation est en cours. La figure 21 résume la méthodologie employée.
Figure 21. Schéma expérimental résumant la méthodologie.
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Chapitre 2 Résultats et discussion |