Présentation sous forme d’affiche au congrès CREFSIP (Centre de Recherche sur la Fonction, la Structure et l’Ingénierie des Protéines) à Québec le 2 mai 2003.

Sélection de peptides inhibiteurs de la fonction GTPase de l’enzyme FtsZ essentielle à la division cellulaire procaryote

Paradis-Bleau Catherine , Boudreault Lydia, Sanschagrin François, Levesque Roger C.

Centre de recherche sur la fonction, la structure et l’ingénierie des protéines (CREFSIP), Université Laval, 4142 Pav. Charles-Eugène-Marchand, département de Biologie Médicale, Faculté de Médecine, Université Laval, Ste-Foy, Québec, G1K 7P4.

Le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa hautement résistant aux antibiotiques infecte 90 % des patients atteints de fibrose kystique ainsi que les personnes immunodéprimées. Afin d’identifier de nouveaux antimicrobiens, nous exploitons la machinerie de division cellulaire procaryote en tant que cible. Tout d’abord, le gène ftsZ de P. aeruginosa a été cloné dans le vecteur de surexpression pET30a et fusionné avec une étiquette histidine en C-terminal. L’enzyme essentielle et hautement conservée FtsZ a été surexprimée dans E. coli BL21 (λDE3) puis purifiée à plus de 99% par chromatographie d’affinité au nickel. L’activité GTPase de FtsZ a été démontrée par TLC puis son identité a été confirmée par séquençage en N-terminal. Nous avons criblé les banques de bactériophages C-7-C et 12-mers avec l’enzyme active. Ces banques contiennent 109 peptides différents fusionnés à la protéine mineur pIII de la capside du phage M13. La spécificité de la technique de présentation phagique a été maximisée et effectuant 3 rondes de biocriblage au cours desquelles la rigueur des lavages a été augmentée puis le temps de contact des phages avec FtsZ a été diminué. Les phages adhérés ont été élués avec de la glycine à pH acide puis de façon compétitive avec le GTP, un analogue non hydrolysable du substrat (5’-guanylylimidodiphosphate) et avec la protéine FtsA qui stabilise l’anneau FtsZ. Ces phages ont été purifiés et l’ADN phagique a été extrait et séquencé. La bioinformatique nous a permis d’identifier trois consensus peptidiques prometteurs contre FtsZ soit deux peptides C7C FtsZp1 et FtsZp2 ainsi qu’un 12 mers FtsZp3. La spécificité de l’interaction entre chacun de ces peptides et FtsZ a été analysée par ELISA. Les peptides synthétisés inhibent l’activité GTPase de FtsZ avec une CI50 de 1,5mM pour les deux peptides C7C et de 5mM pour FtsZp3. Le DTT, un agent réducteur, diminue l’inhibition par FtsZp2 et indique que la conformation du peptide C7C avec son pont disulfure apporte beaucoup à son activité inhibitrice. L’inhibition de FtsZ est d’un intérêt majeur car elle mène à un phénotype létal permettant d’envisager la production de nouveaux antimicrobiens.