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INTRODUCTION

Table des matières

Le muscle squelettique est un tissu qui recouvre le squelette osseux et s'y attache via les tendons. C'est un organe bien délimité qui contient des milliers de fibres musculaires, du tissu conjonctif, des vaisseaux sanguins et des neurofibres. Macroscopiquement, l'ensemble du muscle est recouvert d'une gaine de tissu conjonctif lâche, l'épimysium. À l'intérieur de cette couche sont disposées les fibres musculaires réunies en faisceaux qui sont eux délimités par le périmysium. Cette enveloppe de tissu conjonctif contient des vaisseaux sanguins nécessaires à l'irrigation du muscle qui se prolongent en capillaires pour atteindre toutes les composantes plus internes du muscle. À l'intérieur de chaque faisceau, chacune des fibres musculaires est entourée d'une autre couche de tissu conjonctif lâche appelée endomysium. Chaque fibre musculaire est ensuite entourée d'une membrane plasmique, le sarcolemme, qui abrite le sarcoplasme contenant les nombreux noyaux cellulaires, les mitochondries, le réticulum sarcoplasmique ainsi que d'autres organites plus ou moins spécialisés. Microscopiquement, la fibre musculaire contient des milliers de longues structures cylindriques appelées myofibrilles, qui sont des structures complexes composées de groupes de filaments. Ces myofibrilles constituent l'élément contractile et chacune d'entre elles possède plusieurs unités contractiles, les sarcomères. Ceux-ci sont constitués de plusieurs myofilaments minces d'actine et de myofilaments épais de myosine, dont l'agencement donne naissance à différents types de stries et de bandes. En présence d'ATP et de calcium, le glissement des filaments d'actine le long des filaments de myosine permet le raccourcissement et l'allongement du muscle nécessaires à une contraction musculaire complète. L'anatomie microscopique et macroscopique du muscle squelettique est représentée à la figure 1.

Les tubules transversaux (tubules-T) sont des structures spécialisées qui jouent un rôle fonctionnel clé dans le muscle squelettique. En effet, ces invaginations profondes du sarcolemme sont essentielles à la propagation de l'influx nerveux aux structures impliquées dans la contraction qui sont profondément enfouies dans la cellule. Puisque les tubules-T sont situés tout près du réticulum sarcoplasmique, l'influx nerveux qui est acheminé le long des tubules modifie le réticulum sarcoplasmique, ce qui permet la relâche d'ions calcium essentiels au processus contractile. De plus, ces longues structures tubulaires communiquent avec le milieu interstitiel, permettant également l'approvisionnement vital en glucose, oxygène et ions aux parties plus profondément inscrites dans la cellule. Au niveau métabolique, les tubules-T représentent environ 60 % de la surface cellulaire et c'est pourquoi ils sont principalement responsables de l'augmentation du transport du glucose stimulé notamment par l'insuline et la contraction musculaire (Cullen, MJ, et al. 1984; Dudek, RW, et al. 1994; Eisenberg, BR 1983; Marette, A, et al. 1992; Roy, D and Marette, A 1996).

Des études histologiques du muscle squelettique ont révélé l'existence de deux types majeurs de fibres musculaires : les fibres oxydatives à contraction lente de type I ainsi que les fibres glycolytiques de type II à contraction rapide. Les fibres de type I sont habituellement petites et possèdent une activité de l'ATPase de la myosine qui est lente, d'où le nom de fibres à contraction lente. La présence d'une forte vascularisation ainsi que l'abondance en myoglobine qui emmagasine l'oxygène leurs conférent une couleur rouge. Elles possèdent de nombreuses mitochondries et les enzymes impliquées dans la voie de synthèse aérobie de l'ATP sont très actives. Toutes ces caractéristiques démontrent l'importance du pouvoir oxydatif de ces fibres assurant leur grande résistance à la fatigue ce qui leur permet de soutenir un exercice modéré de longue durée lorsque l'apport en oxygène est suffisant. Alternativement, les fibres musculaires de type II à contraction rapide, et plus particulièrement les fibres de type IIb, sont généralement grosses, peu vascularisées et pauvres en myoglobine et en mitochondries. Elles utilisent donc principalement les voies de dégradation anaérobies pour la synthèse de l'ATP, ce qui conduit à la production d'acide lactique. Bien qu'elles possèdent une réserve plutôt importante de glycogène, la dégradation rapide du glycogène et l'accumulation subséquente d'acide lactique les prédisposent à la fatigue. Ces propriétés accordent donc à ce type de fibres la capacité de se contracter intensément pour une courte durée. Les fibres musculaires de type IIa possèdent des caractéristiques métaboliques et structurales intermédiaires aux fibres de type I et IIb. Tout comme les fibres de type IIb, l'activité de l'ATPase de ce type de fibres est rapide mais leurs besoins en oxygène, leur teneur en myoglobine et leur grande vascularisation les apparentent davantage aux fibres de type I. Puisqu'elles symthétisent l'ATP par des processus aérobies, les fibres de type IIa sont résistantes à la fatigue mais dans une moindre mesure comparativement aux fibres musculaires de type I. Le tableau 1 résume les principales caractéristiques fonctionelles, métaboliques et structurales de ces fibres (Marieb, ÉN 1992; Wilmore, JH and Costill, DL 1994)

Le recrutement des différents types de fibres musculaires est fonction de l'intensité et de la durée de l'effort. Durant un exercice prolongé à faible intensité où la tension musculaire est sous-maximale, le système nerveux recrute préférentiellement les fibres de type I qui sont mieux adaptées aux activités d'endurance. À mesure que l'intensité de l'exercice augmente, on assiste à un recrutement progressif des fibres de type II, et plus particulièrement des fibres de type IIa. Lorsque les fibres de type I et IIa s'épuisent, les fibres de type IIb possédant une capacité glycogénolytique élevée ue à l'abondance de glycogène peuvent entrer en jeu, permettant la poursuite de l'exercice en cours. Les fibres de type IIb sont reconnues pour être davantages sollicitées lors d'un exercice très intense de courte durée.

En plus de permettre le mouvement des membres corporels et la locomotion, la contraction musculaire constitue un processus essentiel au maintien de la vie de plusieurs espèces. Chez l'humain, ce mécanisme permet entre autres d'assurer les fonctions vitales de l'organisme telles que les battements cardiaques, le maintien de la pression artérielle par la contraction et la relaxation des vaisseaux sanguins, la respiration pulmonaire et la digestion. Durant l'exercice physique, le corps humain est soumis à plusieurs formes de stress ce qui l'amènent à enclencher plusieurs mécanismes d'adaptation d'ordre hormonal, physiologique et métabolique nécessitant l'interaction et la coordination de plusieurs systèmes (Hargreaves, M 1995; Marieb, ÉN 1992; Weineck, J 1998; Wilmore, JH and Costill, DL 1994)

La contraction musculaire nécessite une quantité importante d'ATP afin de permettre le glissement des myofilaments dépendant de l'ATPase ainsi que pour activer les pompes à calcium et la Na+/K+-ATPase. Afin de permettre une contraction musculaire soutenue, la cellule doit constamment se munir de mécanismes régénérateurs de l'ATP. Pendant l'activité musculaire, trois systèmes permettent la régénération de l'ATP : le système ATP/céatine phosphate, le système glycolytique et le système oxydatif (Voir figure 2).

L'insuline est une hormone polypeptidique produite et sécrétée par les cellules bêta du pancréas qui a été premièrement isolée et caractérisée par Frederick G. Banting and Charles H. Best au début du 20 ième siècle. La connaissance des différents aspects de l'action de l'insuline a considérablement évolué depuis 80 ans et a permis de déterminer qu'à l'état postprandial, le métabolisme du glucose est primordialement assuré par l'insuline qui stimule la captation du glucose sanguin au niveau des tissus insulino-sensibles comme le tissu adipeux et le muscle squelettique. Le muscle squelettique est un tissu majeur de l'organisme qui représente environ 36 % et 45 % de la masse corporelle chez la femme et l'homme respectivement. Il constitue donc le site majeur de l'utilisation du glucose en période postprandiale, mais également durant la contraction musculaire puisque le glucose constitue le principal substrat énergétique. En effet, la sécrétion élevée d'insuline suite à l'ingestion d'aliments contribue à l'augmentation de la captation musculaire de glucose (Baron, AD, et al. 1988). Durant un clamp euglycémique/hyperinsulinémique, il a été démontré que le muscle squelettique était responsable de 80 % de la captation totale de glucose par l'organisme dans ces conditions (DeFronzo, RA, et al. 1981). Paradoxalement, la sécrétion d'insuline diminue durant l'exercice (Galbo, H 1983) alors que l'augmentation du transport musculaire de glucose est déterminante et essentielle pour fournir l'ATP qui saura répondre aux besoins énergétiques de la cellule musculaire en activité. Le transport du glucose à travers les membranes lipidiques a été démontré comme étant l'étape limitante de son métabolisme (Kubo, K and Foley, JE 1986). Puisque les membranes lipidiques sont imperméables au glucose, l'entrée de glucose à l'intérieur de la cellule suite à une stimulation insulinique ou durant la contraction musculaire est assurée par une famille de transporteurs de glucose à système de transport facilité, les GLUT.

L'entrée du glucose à travers la membrane cellulaire représente un des plus importants systèmes de transport de nutriments dans les cellules de mammifères puisque l'énergie fournie par le métabolisme du glucose joue un rôle capital dans le maintien de l'homéostasie et donc, de la survie cellulaire. Les transporteurs de glucose chez les mammifères (GLUT) assurent la captation du glucose à travers les membranes par un système de transport facilité puisque l'entrée de glucose est dépendante d'un gradient de concentration et ne requiert aucune source d'énergie. Biochimiquement, les GLUTs sont composés de 12 domaines transmembranaires, d'une longueur d'environ 500 acides aminés, dont les extrémités N- et C-terminale pointent vers le cytoplasme (Bell, GI, et al. 1993) (Voir figure 3). Ils appartiennent à une famille de transporteurs de glucose qui compte à ce jour 11 isoformes (GLUT1 à GLUT12) et un pseudo-gène (GLUT6) ne codant pas pour un transporteur de glucose fonctionnel (Voir tableau 2). L'existence de l'isoforme GLUT7 est remise en question puisqu'une étude a révélé qu'il serait associé à une erreur de clonage (Burchell, A 1998). Ces transporteurs diffèrent en termes de distribution tissulaire, de caractéristiques cinétiques et de spécificité relative au type d'hexoses transportés. Aux six isoformes précédemment identifiés (GLUT1 à GLUT6) s'ajoutent cinq nouveaux isoformes qui ont été plus récemment caractérisés. Chacun de ces transporteurs est dérivé d'un gène différent ; les isoformes GLUT1 à GLUT5 présentent une homologie considérable dans leurs séquences en acides aminés alors que ces séquences sont quelque peu différentes pour le second groupe d'isoformes GLUT8 à GLUT12. Outre les isoformes GLUT1 et GLUT4 qui sont exprimés dans les tissus insulino-sensibles, des études révèlent que trois des nouveaux isoformes des GLUTs (GLUT8, GLUT11 et GLUT12) sont exprimés au niveau du muscle squelettique. Plus particulièrement, il a été démontré que l'isoforme GLUT8, connu également sous le nom de GLUTX1, est abondamment exprimé dans les testicules, les blastocytes et à un plus faible niveau dans le muscle squelettique (Carayannopoulos, MO, et al. 2000; Doege, H, et al. 2000; Ibberson, M, et al. 2000; Phay, JE, et al. 2000). De plus, une de ces études révèle que GLUT8/GLUTX1 est mobilisé à la surface cellulaire par l'insuline et contribue à l'augmentation du transport du glucose dans les blastocytes (Carayannopoulos, MO, et al. 2000). Certains travaux récents ont aussi vérifié la distribution tissulaire des isoformes GLUT9 à GLUT12 chez le rat et l'humain (Doege, H, et al. 2000; McVie-Wylie, AJ, et al. 2001; Rogers, S, et al. 2002). Cependant, aucune de ces études n'a vérifié le rôle de ces derniers isoformes dans la stimulation du transport du glucose induite par l'insuline ou la contraction musculaire dans les tissus insulino-sensibles.

FIGURE 3Figure_3 : Structure moléculaire d'un transporteur de glucose. (Schéma emprunté à Bell et al. 1993).

TABLEAU 2 : Les transporteurs de glucose à système de transport facilité chez les mammifères : Distribution tissulaire et fonctions physiologiques.

Nom

Distribution tissulaire

Fonctions

GLUT1

Érythrocytes, cellules endothéliales, cerveau, placenta, muscle et tissu adipeux

Transport du glucose basal et à travers la barrière hémato-encéphalique

GLUT2

Foie, cellules bêta du pancréas, intestin, rein

Transport bidirectionnel du glucose dans les hépatocytes Relâche de glucose par les cellules de l'intestin et du rein Senseur de glucose dans les cellules bêta du pancréas

GLUT3

Humain : cerveau, tissu adipeux, rein, foie, muscle

Autres espèces : limitée au cerveau

Transporteur principal du glucose au niveau des neurones

GLUT4

Muscle squelettique et cardiaque, tissu adipeux blanc et brun

Transport du glucose régulé par l'insuline et la contraction

GLUT5

Intestin, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein

Transport du fructose

GLUT6

Pseudogène

--------------

GLUT8/ GLUTX1

Blastocytes, testicules, muscle squelettique

Transport du glucose insulino-sensible au niveau des blastocytes

GLUT9

Leucocytes, cerveau, foie, rein

Transport du glucose, mécanismes de régulation inconnus

GLUT10

Foie, pancréas

Proposé comme gène de susceptibilité au diabète

GLUT11

Muscle squelettique et cardiaque

Transport du glucose, mécanismes de régulation inconnus

GLUT12

Muscle squelettique, tissu adipeux et petit intestin

Transport du glucose, mécanismes de régulation inconnus

Le transporteur de glucose GLUT1 fut le premier isoforme à être caractérisé dans les cellules de mammifères. Son expression a été observée dans plusieurs tissus, principalement au niveau du placenta, du cerveau, des érythrocytes, des yeux, des reins et à un moindre niveau dans les tissus insulino-sensibles i.e. les muscles squelettique et cardiaque ainsi que les tissux adipeux blanc et brun. De façon générale, l'expression de GLUT1 est augmentée par une variété de stimuli qui favorisent la croissance ou la division cellulaire requérant davantage d'énergie comme l'insuline, le PDGF, l'IGF-1, le TGF-b, les hormones thyroïdiennes et de croissance ainsi que certains oncogènes (Birnbaum, MJ, et al. 1987; Kitagawa, T, et al. 1991; Maher, F, et al. 1989; Rollins, BJ, et al. 1988; Tai, PK, et al. 1990; Tordjman, KM, et al. 1989; Weinstein, SP, et al. 1990) le glucose ayant par contre un effet contraire sur l'expression de cet isoforme (Walker, PS, et al. 1988; Wertheimer, E, et al. 1991).

Dans le muscle squelettique, GLUT1 représente environ 3 à 5 % du nombre total des transporteurs de glucose. Il est localisé principalement à la membrane plasmique de ces cellules et est responsable du transport de glucose basal au niveau des tissus insulino-sensibles (Marette, A, et al. 1992; Zorzano, A, et al. 1989). Ce transporteur est également retrouvé dans les membranes internes du tissu adipeux. Dans ce dernier tissu, il a été démontré que l'insuline induisait une augmentation de la translocation de GLUT1 à la membrane plasmique, avec une diminution concomitante de ce transporteur à partir d'un réservoir interne contenant environ 50 % de la totalité des GLUT1 (Czech, MP and Buxton, JM 1993; James, DE, et al. 1988; Kahn, BB, et al. 1987; Slot, JW, et al. 1991). Toutefois, aucune translocation de GLUT1 n'a pu être observée dans le muscle squelettique en présence d'insuline ou lors de la contraction musculaire, sa localisation étant exclusivement associée à la membrane plasmique, et absente au niveau des tubules transversaux et des membranes internes (Dombrowski, L, et al. 1996; Douen, AG, et al. 1990; Marette, A, et al. 1992; Zorzano, A, et al. 1996). De plus, on a observé un niveau d'expression supérieur de GLUT1 au niveau des fibres musculaires oxydatives de type I comparativement aux fibres glycolytiques de type II (Goodyear, LJ, et al. 1991; Marette, A, et al. 1992).

GLUT4 constitue le principal transporteur de glucose responsable de l'augmentation de la captation du glucose induite par l'insuline ou la contraction musculaire et représente plus de 90 % de la totalité des transporteurs de glucose exprimés dans le muscle squelettique et cardiaque, et dans le tissu adipeux blanc et brun (Holman, GD, et al. 1990; Marette, A, et al. 1992). En effet, l'importance de cette contribution est supportée par le fait que la translocation de GLUT4 est cinq fois supérieure à celle de GLUT1 dans les cellules adipeuses (Calderhead, DM, et al. 1990; Holman, GD, et al. 1990). De plus, GLUT4 possède une affinité supérieure pour le glucose que GLUT1, révélée par un Km de 2-5 mM pour GLUT4 et de 7-10 mM pour GLUT1 (Gould, GW and Holman, GD 1993). L'expression de GLUT4 est restreinte aux tissus insulino-sensibles (Birnbaum, MJ 1989; James, DE, et al. 1989). Au niveau du muscle squelettique, la distribution de GLUT4 diffère selon le type de fibres musculaires. Tout comme pour GLUT1, des études ont estimé que GLUT4 est quatre fois plus abondamment exprimé dans les fibres musculaires oxydatives que dans les fibres glycolytiques (Goodyear, LJ, et al. 1991; Henriksen, EJ, et al. 1990; Johannsson, E, et al. 1996; Marette, A, et al. 1992), ce qui pourrait expliquer que les fibres oxydatives sont davantage sensibles à l'effet de l'insuline et de la contraction musculaire sur le transport du glucose que les fibres glycolytiques (Ploug, T, et al. 1987; Song, XM, et al. 1999).

Les mécanismes cellulaires qui modulent la captation du glucose au niveau du muscle squelettique sont complexes. Afin d'être métabolisé, le glucose sanguin doit_ entre autres_ franchir plusieurs barrières cellulaires pour finalement atteindre le cytoplasme de la cellule. Il doit notamment être transporté du sang vers l'espace interstitiel et ensuite vers l'espace intracellulaire. Le mouvement du glucose des capillaires sanguins vers l'intérieur de la cellule est déterminé principalement par le flot sanguin via le recrutement des capillaires, le gradient de concentration du glucose mais aussi par le nombre et l'activité des transporteurs de glucose GLUT4 mobilisés à la surface cellulaire des myocytes par l'insuline et la contraction musculaire.

Au début des années 80, deux groupes de chercheurs se sont intéressés à étudier les mécanismes cellulaires contribuant à l'augmentation de la captation du glucose dans les tissus cibles de l'organisme. Ils ont alors utilisé l'insuline comme modèle expérimental afin de démontrer que le principal mécanisme par lequel cette hormone stimule la captation du glucose dans les cellules adipeuses s’effectuait par la translocation de transporteurs de glucose à partir d'un compartiment intracellulaire jusqu'à la membrane plasmique (Cushman, SW and Wardzala, LJ 1980; Suzuki, K and Kono, T 1980). Ce processus de translocation a ensuite été démontré dans les autres tissus insulino-sensibles comme le muscle squelettique (Klip, A, et al. 1987) et cardiaque (Zaninetti, D, et al. 1988). Au niveau du muscle squelettique, il a été démontré qu'en plus de la membrane plasmique, l'insuline induisait la translocation de GLUT4 au niveau d'un second compartiment de surface, les tubules-T et ce, tant au niveau des fibres musculaires oxydatives que glycolytiques (Dohm, GL, et al. 1993; Marette, A, et al. 1992).

Parallèlement, plusieurs travaux ont également démontré que la stimulation du transport du glucose induite par la contraction musculaire était attribuable à une augmentation du contenu en GLUT4 au niveau de la membrane plasmique et des tubules-T des myofibres oxydatives et glycolytiques (Douen, AG, et al. 1989; Hirshman, MF, et al. 1988; Roy, D and Marette, A 1996). Toutefois, la contraction musculaire in situ semble stimuler davantage la translocation de GLUT4 au niveau des tubules-T des fibres musculaires glycolytiques qu’oxydatives (Roy, D, et al. 1997). En utilisant différentes techniques de fractionnement membranaire afin d'isoler les membranes de surface et le compartiment intracellulaire, on a de plus démontré que la contraction musculaire in vitro, in situ, ainsi que l’exercice physiqueinduisait spécifiquement la translocation de GLUT4, et non celle de GLUT1 (Roy, D, et al. 1997; Roy, D and Marette, A 1996) ou de GLUT5 (Kristiansen, S, et al. 1997) à la surface cellulaire.

Puisque les tubules-T représentent 60 à 70 % de la surface cellulaire des myocytes, ces structures ont été proposées comme étant le principal compartiment de surface contribuant à l'augmentation du transport du glucose activé par l'insuline et la contraction musculaire. En effet, de nombreuses études immunocytochimiques indiquent que la majorité des GLUT4 associés à la surface cellulaire sont situés au niveau des tubules-T comparativement à la membrane plasmique au niveau basal (Dudek, RW, et al. 1994; Friedman, JE, et al. 1991). Sous l'action de l'insuline et suite à la contraction musculaire, il a été démontré par immunobuvardage que pour une même quantité de protéines purifiées à partir des différentes fractions membranaires, le niveau de translocation de GLUT4 à la membrane plasmique et aux tubules-T était similaire (Dombrowski, L, et al. 1996; Roy, D and Marette, A 1996). Cependant, si l'on considère l'ensemble de la surface cellulaire du muscle composée majoritairement de tubules-T, la quantité absolue de GLUT4 recrutés à la surface cellulaire sous l'action de ces stimuli est plus importante au niveau des tubules-T qu'au niveau de la membrane plasmique. Ces données ont d'ailleurs été confirmées par détection immunocytochimique de GLUT4 dans le muscle stimulé par l'insuline chez des souris trangéniques surexprimant GLUT4 (Dudek, RW, et al. 1994; Wang, W, et al. 1996).

L'activité intrinsèque des transporteurs de glucose GLUT se définit par le nombre maximal de molécules de glucose transportées de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule par unité de temps, impliquant un mouvement mécanique de bascule des transporteurs communément appelé mécanisme de “flip-flop”. En plus de la translocation des transporteurs de glucose, il a été proposé que la stimulation maximale du transport du glucose nécessite une augmentation de l'activité intrinsèque des transporteurs mobilisés à la surface cellulaire (Moyers, JS, et al. 1996; Zierler, K 1998). En support à cette hypothèse, des travaux ont démontré une dissociation entre la translocation des GLUTs et le transport du glucose stimulé par l'insuline dans le muscle squelettique (Hansen, PA, et al. 1998) et le tissu adipeux (Armoni, M, et al. 1995). Cette dissociation a également été remarquée dans une étude où la leptine inhibait le transport du glucose dépendant de l'insuline sans affecter la translocation de GLUT4myc dans les cellules musculaires L6 en culture (Sweeney, G, et al. 2001). Ces cellules surexpriment GLUT4 qui contient un épitope myc associé à sa partie exofaciale. Puisque la translocation de GLUT4 est mesurée en utilisant un anticorps dirigé contre l'épitope myc exposé à la surface cellulaire, ceci permet de s'assurer que GLUT4 est efficacement inséré à la membrane plasmique et donc fonctionnellement apte à transporter le glucose. Plus récemment, plusieurs évidences laissent croire que l'enzyme p38 MAPK serait impliquée dans l'activation de GLUT4, contribuant ainsi à augmenter maximalement le transport du glucose stimulé par l'insuline ou la contraction musculaire (discuté à la section 3.3).

Il est maintenant reconnu que la phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3 kinase) de classe IA est un médiateur intracellulaire clé dans l'effet stimulateur de l'insuline sur le transport du glucose et la translocation de GLUT4 dans les tissus insulino-sensibles (Clarke, JF, et al. 1994; Farese, RV 2001; Frevert, EU and Kahn, BB 1997; Hara, K, et al. 1994; Kotani, K, et al. 1995; Litherland, GJ, et al. 2001; Tanti, JF, et al. 1996). Le modèle simplifié de la signalisation insulinique (voir figure 4) implique que la liaison de l'insuline au domaine extracellulaire a de son récepteur (IR) induit une autophosphorylation sur les résidus tyrosine de la sous-unité intracellulaire b de IR, ce qui a pour effet d'augmenter l'activité tyrosine kinase du IR. Les résidus tyrosine phosphorylés de IR permettent la liaison des protéines IRS (IRS-1 à 4) via leur domaine PTB, ce qui induit le recrutement des IRS à la membrane cellulaire. Le récepteur de l'insuline activé induit alors une phosphorylation des IRS sur leurs résidus tyrosine, ceux-ci permettant ensuite la liaison de la sous-unité régulatrice p85 de la PI-3 kinase via son domaine SH2. Cette dernière liaison induit un changement conformationnel de la sous-unité catalytique p110 de la PI-3 kinase ce qui a pour effet d'activer cette enzyme. La PI-3 kinase activée phosphoryle la phophatidylinositol-4,5-phosphate (PI(4,5)P2) de la membrane cellulaire, ce qui génère le composé lipidique PI(3,4,5)P3. Ce second messager permet ensuite le recrutement de la serine/thréonine kinase Akt/PKB à la membrane plasmique qui se lie au PI(3,4,5)P3 via son domaine PH. L'interaction de la kinase Akt/PKB avec PI(3,4,5)P3 n'active pas directement l'enzyme mais permet plutôt aux protéines kinases PDK-1 et PDK-2 d'activer l'Akt/PKB par phosphorylation des résidus thréonine 308 et sérine 473, respectivement. Suite à son activation, l'Akt/PKB se dissocie de la membrane plasmique et peut ensuite phosphoryler certains substrats cytoplasmiques et nucléaires comme l'enzyme GSK-3 (Cross, DA, et al. 1995), la protéine mTOR (Nave, BT, et al. 1999) et l'enzyme eNOS (Montagnani, M, et al. 2001).

La nature des différents effecteurs de la PI-3 kinase impliqués dans l'action stimulatrice de l'insuline sur le transport du glucose et la translocation de GLUT4 demeure à ce jour encore mal définie, mais plusieurs travaux suggèrent un rôle de l'Akt/PKB dans le métabolisme du glucose activé par l'insuline (Cong, LN, et al. 1997; Hajduch, E, et al. 1998; Kohn, AD, et al. 1996; Wang, Q, et al. 1999). De plus, certaines études suggèrent que la protéine kinase C (PKC), et plus particulièrement les PKC atypiques (aPKC), constitue un second effecteur agissant en aval de la PI-3 kinase pour stimuler le transport du glucose insulino-dépendant dans les cellules musculaires et adipeuses (Bandyopadhyay, G, et al. 2000; Kotani, K, et al. 1998; Nakanishi, H, et al. 1993; Standaert, ML, et al. 1997). Cependant, d'autres travaux sont en désaccord avec l'implication des aPKC dans la stimulation du transport du glucose dans les adipocytes 3T3-L1 (Tsuru, M, et al. 2002).

Des études plus récentes ont suggéré que l'insuline stimule le transport du glucose par une autre voie de signalisation intracellulaire indépendante de la PI-3 kinase mais essentielle pour activer maximalement la captation du glucose hormono-dépendante (Saltiel, AR and Kahn, CR 2001). En effet, certains travaux ont démontré que le complexe CAP/Cbl et la protéine TC10 sont activés par l'insuline et contribuent à stimuler le transport du glucose et la translocation de GLUT4 dans les adipocytes 3T3-L1 (Baumann, CA, et al. 2000; Chiang, SH, et al. 2001; Ribon, V and Saltiel, AR 1997; Watson, RT, et al. 2001). Il a été démontré que le récepteur de l'insuline active la tyrosine phosphorylation de la protéine proto-oncogène, c-Cbl, qui active à son tour la protéine TC10 en présence d'un adapteur protéique CAP liant c-Cbl (Ribon, V and Saltiel, AR 1997). Cette voie de signalisation est également représentée à la figure 4.

Depuis quelques années, des progrès considérables ont été réalisés afin de clarifier les mécanismes intracellulaires par lesquels l'exercice ou la contraction musculaire active la captation du glucose et la translocation de GLUT4 dans le muscle squelettique. Il est reconnu que les effets de la contraction musculaire sont tout à fait indépendants de l'action de l'insuline puisque la contraction musculaire de muscles isolés peut stimuler le transport du glucose même en absence d'insuline (Nesher, R, et al. 1985; Ploug, T, et al. 1984; Richter, EA, et al. 1985). Contrairement à l'insuline, il a été rapporté que la PI-3 kinase n'est pas impliquée dans la stimulation du transport du glucose et la translocation de GLUT4 par la contraction musculaire ou par l'exercice (Voir section 4.1.1). Toutefois, certaines évidences suggèrent que le calcium, les protéines kinases C et B, l'hypoxie, l'adénosine, l'AMPK ainsi que le monoxyde d'azote (Voir section 6.3.2) pourraient intervenir dans le mécanisme d'action liant la contraction musculaire et la captation de glucose. L'implication possible des MAPK dans ces effets sera également discutée.

En plus d'être essentiel au processus contractile, il a été proposé que le calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique contribue à l'activation du transport du glucose durant l'exercice (Holloszy, JO, et al. 1986). En absence de dépolarisation membranaire, on a observé une augmentation du transport du glucose stimulé par la cafféine, un agent inducteur de la contraction qui stimule la relâche de calcium par le réticulum sarcoplasmique (Holloszy, JO and Narahara, HT 1967). D'autre part, une étude révèle que la relâche de calcium induite par le W-7 produit une augmentation du transport du glucose même en absence de contraction musculaire (Youn, JH, et al. 1991). Dans cette dernière étude, l'observation d'un effet additif du W-7 et de l'insuline, mais pas du W-7 et la contraction musculaire, sur le transport du glucose suggère que le calcium participe à l'activation du transport du glucose par la contraction musculaire, et non à l'effet de l'insuline. De plus, le blocage de la relâche de calcium par la dandrolène provoque une inhibition du transport du glucose induit par la contraction (Nolte, LA, et al. 1995), le W-7 (Youn, JH, et al. 1991) et par la phospholipase C (Henriksen, EJ, et al. 1989). À ce jour, aucune étude n'a contredit ces résultats. Ces observations proposent donc un rôle unique au calcium dans l'effet stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du glucose, pouvant se traduire soit par un effet direct du calcium sur le transport du glucose ou par l'activation de molécules intracellulaires impliquées dans cet effet. Cependant, il a été proposé que le calcium n'active pas directement le transport du glucose durant la contraction musculaire puisque la concentration de calcium cytoplasmique durant l'activité contractile ne s'élève que durant quelques secondes alors que le transport du glucose est activé et maintenu durant plusieurs minutes. De plus, des études démontrent que des agents inducteurs de la relâche de calcium inhibent l'action stimulatrice de l'insuline sur le transport du glucose, cet effet étant opposé à celui observé en présence simultanée d'insuline et de contraction musculaire (Draznin, B, et al. 1987; Lee, AD, et al. 1995). L'ensemble de ces évidences suggèrent donc que le calcium initie ou facilite l'activation des molécules de signalisation impliquées dans la stimulation du transport du glucose par la contraction musculaire mais ne participe pas de façon directe à cet effet.

Les protéines kinases C (PKC), et plus particulièrement les PKC nouvelles (nPKC) et conventionnelles (cPKC), comptent parmi les médiateurs intracellulaires sensibles au calcium qui ont été proposés comme jouant un rôle dans l'effet de la contraction sur le transport du glucose. En effet, on a rapporté une activation du transport du glucose dans le muscle squelettique suite au traitement avec un agent activateur des PKC, le phorbol ester (Hansen, PA, et al. 1997; Henriksen, EJ, et al. 1989). De plus, l'inhibition des PKC par la calphostine C (Ihlemann, J, et al. 1999; Wojtaszewski, JF, et al. 1998) et la polymixine B (Henriksen, EJ, et al. 1989; Young, JC, et al. 1991) réduit le transport du glucose stimulé par la contraction musculaire ou l'exercice. Lors des contractions musculaires in situ et in vitro, on a également noté une augmentation de la translocation des PKC du cytosol vers des compartiments membranaires parallèlement à une activation des PKC associées à la fraction membranaire (Cleland, PJ, et al. 1989; Richter, EA, et al. 1987). Ces évidences suggèrent donc que les PKC participent à l'activation de la captation du glucose par la contraction musculaire. Toutefois, les rôles des différents isoformes des PKC dans l'activation du transport du glucose induite par la contraction musculaire ne sont à ce jour pas clairement définies. Plus récemment, il a été rapporté que la contraction musculaire et un agent activateur de l'AMPK, le AICAR, stimulent l'activité calcium-indépendante des aPKC au niveau du muscle squelettique (Chen, HC, et al. 2002). Par l'utilisation d'inhibiteurs et par l'expression d'une forme dominante négative des aPKC, ce dernier groupe de chercheurs a démontré que le AICAR active le transport du glucose et la translocation de GLUT4 par un mécanisme dépendant, entre autres, de l'activation de la phospholipase D et des aPKC, mais indépendant de la PI-3 kinase, dans les cellules musculaires L6 en culture.

Des études plus récentes proposent également un rôle pour la protéine kinase B ou Akt, et plus particulièrement l'Akt 1 (Turinsky, J and Damrau-Abney, A 1999), dans l'effet de la contraction musculaire sur le transport du glucose. En effet, il a été démontré que la contraction musculaire in situ ou l'exercice augmentent de façon rapide et transitoire l'activité de l'Akt et le transport du glucose dans les muscles EDL et soléaire et ce, indépendamment de l'activation de la PI-3 kinase (Nader, GA and Esser, KA 2001; Sakamoto, K, et al. 2002). D'autre part, aucune activation de l'Akt n'a été notée lors de la contraction du muscle soléaire in vitro (Lund, S, et al. 1998; Nader, GA and Esser, KA 2001; Sakamoto, K, et al. 2002). Cependant, plusieurs études sont en désaccord avec ces observations, ces divergences semblant être attribuables aux types de contractions utilisées ainsi qu'au temps de stimulation (Brozinick, JT, Jr. and Birnbaum, MJ 1998; Sherwood, DJ, et al. 1999; Widegren, U, et al. 1998; Wojtaszewski, JF, et al. 1999). Le rôle de cette kinase dans l'action de la contraction musculaire sur le transport du glucose demeure donc encore controversé.

L'hypoxie constitue un autre facteur pouvant contribuer à l'effet stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du glucose. En effet, la disponibilité réduite de l'oxygène lors d'un exercice intense peut conduire au recrutement de différentes voies de signalisation pour activer le transport du glucose. Des études récentes révèlent un effet additif de l'hypoxie et de la contraction dans le muscle perfusé (Derave, W and Hespel, P 1999), cet effet étant restreint aux muscles enrichis en myofibres de type IIa (Fluckey, JD, et al. 1999). Cependant, certains travaux contradictoires à cette conclusion ont démontré que l'hypoxie stimule le transport du glucose de façon non additive à la contraction musculaire dans le muscle épitrochlearis isolé (Cartee, GD, et al. 1991; Idstrom, JP, et al. 1986; Youn, JH, et al. 1994) ou dans des muscles perfusés (Wojtaszewski, JF, et al. 1998). Par ailleurs, une étude récente démontre que la kinase activée par l'AMP constitue le seul médiateur impliqué dans l'effet stimulateur de l'hypoxie sur le transport du glucose, mais que l'activation de cette enzyme contribue partiellement à l'effet de la contraction musculaire (Mu, J, et al. 2001). Par conséquent, ces données suggèrent que la contraction musculaire utilise, du moins en partie, la même voie de signalisation intracellulaire utilisée par l'hypoxie pour stimuler la captation du glucose, cette voie étant dépendante de l'activation de l'AMPK.

Dans la littérature, il a été décrit qu'en absence d'insuline, l'adénosine produite durant la contraction musculaire pourrait contribuer, par un mécanisme autocrine ou en augmentant le flot sanguin, à l'activation du transport du glucose observée dans le muscle squelettique. En effet, l'adénosine formée dans le cytoplasme des cellules musculaires peut atteindre le milieu interstitiel et possiblement exercer des effets locaux sur le transport du glucose en se liant à ses récepteurs situés sur les cellules musculaires adjacentes (Stiles, GL 1992)_ Ainsi, il a été observé que l'ajout d'adénosine augmente le transport du glucose durant la contraction du muscle cardiaque et ce, en absence d'insuline (Angello, DA, et al. 1993; Wyatt, DA, et al. 1989). De plus, une étude démontre qu'en bloquant l'action de l'adénosine, on observe une inhibition du transport du glucose stimulé par la contraction musculaire dans les muscles épitrochlearis et soléaire isolés et ce, en absence et en présence d'insuline (Han, DH, et al. 1998). Une étude chez l'humain rapporte également que l'administration d'un antagoniste non-spécifique du récepteur de l'adénosine, la théophylline, réduit le taux de disparition plasmatique du glucose durant l'exercice (Raguso, CA, et al. 1996). De plus, il a été suggéré que l'adénosine active le transport du glucose dépendant des protéines G, ou en modulant l'activité intrinsèque des transporteurs de glucose à la membrane plasmique (Kuroda, M, et al. 1987). Toutefois, quelques travaux révèlent une absence d'inhibition du transport du glucose musculaire en présence d'antagonistes des récepteurs de l'adénosine durant la contraction in situ, cet effet inhibiteur étant uniquement observable qu'en présence d'insuline et au niveau des muscles oxydatifs à contraction lente (Derave, W and Hespel, P 1999; Vergauwen, L, et al. 1994). Ceci suggère donc que l'adénosine exercerait plutôt un effet synergique dans l'action de l'insuline et de la contraction musculaire sur le transport du glucose. De façon générale, ces observations suggèrent donc un rôle potentiel mais encore controversé de l'adénosine dans le transport du glucose stimulé par la contraction musculaire en absence et en présence d'insuline.

Les protéines MAPK (mitogen-activated protein kinase) sont des enzymes qui ont été proposées comme étant impliquées dans les mécanismes adaptatifs de plusieurs types cellulaires en réponse aux stress, comme ceux qui surviennent dans le muscle squelettique durant l'exercice (Kyriakis, JM, et al. 1994; Leppa, S, et al. 1998; Pages, G, et al. 1993). Cette famille d'enzymes est impliquée dans trois principales voies de signalisation : la voie ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases), la voie p38 MAPK et la voie JNK (c-jun NH2 terminal kinases). Des études chez les rongeurs et l'humain proposent que l'activation de ces molécules durant l'exercice participe à la régulation de la prolifération et de la différenciation cellulaire en activant certaines protéines kinases ou facteurs de transcription (Boppart, MD, et al. 2000; Widegren, U, et al. 1998). En effet, les résultats de plusieurs travaux indiquent que l'exercice et la contraction musculaire de muscles isolés stimulent l'activation de EKR1/2, de la p38 MAPK et des JNK (Aronson, D, et al. 1997; Goodyear, LJ, et al. 1996; Widegren, U, et al. 1998). De plus, certains travaux démontrent que l'activation des MAPK durant l'exercice est directement associée à l'activité contractile, excluant donc la contribution de certains facteurs systémiques ou humoraux (Boppart, MD, et al. 2001; Hayashi, T, et al. 1999). Bien que certaines évidences suggèrent un rôle de la p38 MAPK dans l'activation du transporteur GLUT4 par la contraction musculaire (Voir section 3.3), les MAPK ERK1/2 et les JNK ne semblent pas impliquées dans la stimulation du transport du glucose. En effet, le traitement du muscle soléaire isolé avec un inhibiteur des MAPK, le PD-98059, n'a induit aucune diminution du transport du glucose stimulé par la contraction musculaire in vitro (Hayashi, T, et al. 1999) ou dans des muscles perfusés (Wojtaszewski, JF, et al. 1999). Conjointement, ces résultats indiquent que les MAP kinases ERK1/2 et JNK ne sont pas impliquées dans l'effet stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du glucose mais interviennent plutôt dans la régulation des mécanismes adaptatifs à l'exercice, notamment sur la transcription de certains gènes.

L'AMPK de mammifères a été purifiée chez plusieurs espèces incluant l'humain, le rat et le porc. Elle fut en tout premier lieu caractérisée et analysée chez les levures Saccharomyces cerevisiae. En fait, il a été rapporté que la séquence en acides aminés de la sous-unité catalytique hépatique de l'AMPK chez le rat s'apparentait grandement à celle de la kinase SNF-1 retrouvée chez ces moisissures (Carling, D, et al. 1994). De plus, l'AMPK a été fonctionnellement associée à la kinase SNF-1 puisqu'il a été démontré que les deux kinases pouvaient phosphoryler le même type de substrats comme par exemple l'acétyl-CoA carboxylase et la HMG-CoA réductase, et aussi être phosphorylées in vitro par le même type de kinases telles que l'AMPK kinase (AMPKK) (Hardie, DG, et al. 1998). Chez les mammifères, l'AMPK a ensuite été caractérisée comme un hétérotrimère composé d'une sous-unité catalytique alpha (a), subdivisée en deux isoformes a1 et a2 ainsi que de deux sous-unités régulatrices, bêta et gamma (b et g), subdivisée en isoformes b1 et b2 et en g1, g2 et g3 (Beri, RK, et al. 1994; Cheung, PC, et al. 2000; Hardie, DG, et al. 1998). La sous-unité catalytique contient le domaine kinase, le site de phosphorylation de l'AMPK sur le résidu thréonine 172 et le site de liaison de l'AMP. De plus, il fut démontré que les isoformes a2 et g2 seraient davantage sensibles à l'activation par l'AMP comparativement aux autres isoformes (Cheung, PC, et al. 2000; Salt, I, et al. 1998; Wojtaszewski, J, et al. 2000). À ce jour, seulement deux sous-unités régulatrices de l'AMPK ont été identifiées et il semble que leur interaction avec la sous-unité catalytique soit essentielle pour conférer une activité optimale à l'enzyme (Cheung, PC, et al. 2000) (Dyck, JR, et al. 1996) (Woods, A, et al. 1996).

Chez le rat, l'analyse par immunobuvardage de lysats tissulaires semble indiquer que la distribution de l'AMPK est ubiquitaire puisqu'elle est exprimée au niveau du cerveau, du pancréas, des reins, des poumons, des testicules, du foie et dans le muscle squelettique et cardiaque (Woods, A, et al. 1996). Par contre, le contenu relatif des différentes sous-unités et de leurs isoformes varie selon les tissus analysés. Par exemple, l'expression des sous-unités a1, b1 et g1 et g2 est ubiquitaire, les sous-unités a2 et b2 se retrouvant principalement au niveau du muscle squelettique et cardiaque et au niveau du foie, alors que la sous-unité g3 serait restreinte au muscle squelettique (Cheung, PC, et al. 2000; Stapleton, D, et al. 1996). Des travaux récents concernant la sous-unité g3 ont indiqué que seule l'expression de cet isoforme est augmentée par l'entraînement physique et ce, uniquement au niveau du muscle quadriceps rouge et non au niveau du quadriceps blanc et du muscle soléaire (Durante, PE, et al. 2002). En effet, cette étude révèle que l'expression des autres isoformes de la sous-unité g ainsi que les isoformes des sous-unités a et b n'est pas significativement altérée par l'entraînement physique. De plus, la mutation spécifique du gène PRKAG3 codant pour la sous-unité g3 de l'AMPK entraîne une diminution de l'activité de l'AMPK et une augmentation du contenu en glycogène musculaire chez le porc Hampshire (Milan, D, et al. 2000). Il a été suggéré que cette mutation activerait en premier lieu l'AMPK, ce qui produirait une augmentation du transport du glucose et de la synthèse de glycogène et que l'inhibition subséquente de l'activité de l'AMPK serait secondaire à un mécanisme de régulation négative dû à la synthèse accrue de glycogène (Derave, W, et al. 2000; Hamilton, SR, et al. 2001). Considérant les résultats de ces deux dernières études, il a donc été suggéré que la sous-unité g3 serait impliquée dans l'augmentation du contenu en glycogène musculaire dans les myofibres oxydatives observée suite à l’entraînement physique. Par ailleurs, l'analyse par immunobuvardage a révélé que le muscle épitrochlearis de rat était davantage enrichi en sous-unité a1 et a2 que le muscle soléaire, celui-ci présentant un contenu en a2 supérieur à l'a1 (Ai, H, et al. 2002). De plus, seule l'association de la sous-unité b1 à la sous-unité a2 est observée dans le muscle soléaire alors que dans le muscle EDL, la sous-unité a2 est associée à la sous-unité b1 et b2 (Chen, Z, et al. 1999; Durante, PE, et al. 2002). Dans le muscle soléaire, la sous-unité g1 est prédominante comparativement aux autres sous-unités g (Durante, PE, et al. 2002).

De façon générale, le modèle d'activation de l'AMPK proposé implique que l'AMPKa serait spécifiquement phosphorylée sur un résidu thréonine (Thr 172) par l'AMPKK (Hawley, SA, et al. 1996) ou activée par l'AMP et la créatine selon différents mécanismes. Ceux-ci incluent une activation allostérique directe de l'AMPK par l'AMP et la créatine. À l'inverse, l'activité de l'AMPK est inhibée par la créatine-phosphate et l'ATP. De plus, la liaison de l'AMP à la sous-unité alpha induirait une amplification de la phosphorylation de l'AMPK par l'AMPKK et une diminution de l'affinité des phosphatases, notamment les PP2C et PP2A qui déphosphorylent l'AMPK (Ruderman, NB, et al. 1999; Winder, WW 2001). Cependant, il semble que l'association des sous-unités en un complexe trimérique constitue une étape préalable à l'activation de l'AMPKa. Les modèles d'activation suggérés (Voir figure 5) impliquent qu'en absence d'AMP, ce complexe existe dans une conformation inactive où les sous-unités a et g n'interagissent pas. Dans ces conditions, le site actif du domaine kinase (sous-unité a) contenant le site de phosphorylation de l'AMPK sur le résidu thréonine est masqué par un domaine autoinhibiteur, ce qui bloque l'accessibilité du résidu thréonine et donc la phophorylation de l'AMPK par l'AMPKK. Dans la conformation active, l'AMP permet l'interaction du domaine autoinhibiteur avec la sous-unité g, ce qui démasque le site de phosphorylation sur la sous-unité a. Plus spécifiquement, il a été proposé que la sous-unité b pourrait induire un changement conformationnel de la sous-unité a, ce qui favoriserait ensuite son interaction avec la sous-unité g via l'AMP, permettant ainsi l'activation de la sous-unité a et l'assemblage adéquat et stable du complexe (Cheung, PC, et al. 2000; Winder, WW 2001; Woods, A, et al. 1996).

Lors de la contraction musculaire, l'augmentation accrue des besoins en énergie du muscle favorise l'utilisation de substrats énergétiques riches en phosphate tels que l'ATP et la créatine phosphate. À mesure que le muscle contracte, les ratios AMP/ATP ainsi que créatine/créatine phosphate augmentent. Il a donc été proposé que la modification de l'équilibre de ces ratio pourrait contribuer à activer l'AMPK et le transport du glucose durant la contraction musculaire (Goodyear, LJ 2000; Winder, WW 2001; Winder, WW and Hardie, DG 1999). De plus, il semble que l'équilibre de ces ratios varie en fonction de l'intensité et de la durée du travail musculaire. Ainsi, il a été observé chez les rongeurs et l'humain que le transport du glucose ainsi que l'activation de l'AMPK sont positivement corrélés à l'intensité de l'exercice (Rasmussen, BB and Winder, WW 1997; Wojtaszewski, J, et al. 2000) ainsi qu'à la force et à la fréquence des contractions (Ihlemann, J, et al. 1999; Ihlemann, J, et al. 2000). L'exercice à haute intensité chez l'humain et la contraction in situ chez le rat ont révélé une augmentation sélective de l'activité de la sous-unité a2 de l'AMPK et non de la sous-unité a1 (Fujii, N, et al. 2000; Musi, N, et al. 2001; Musi, N, et al. 2001; Stephens, TJ, et al. 2002; Vavvas, D, et al. 1997; Wojtaszewski, J, et al. 2000). Lors de l'exercice à faible intensité, aucun changement de l'activité de ces deux isoformes n'a été rapporté (Fujii, N, et al. 2000; Wojtaszewski, J, et al. 2000). De plus, des travaux ont indiqué que la contraction du muscle épitrochlearis isolé produisait une augmentation de l'activité des sous-unités a1 et a2 de l'AMPK chez les rats normaux alors que chez les rats insulino-résistants Zucker, seul l'AMPKa2 était activée par la contraction (Barnes, BR, et al. 2002). Dans cette étude, la contraction stimulait le transport du glucose de façon normale chez les rats insulino-résistants malgré l'absence d'activation de l'AMPKa1 ce qui suggère que cette sous-unité ne joue pas un rôle essentiel dans le transport du glucose stimulé par la contraction. Chez l'humain, deux études ont par contre démontré une activation simultanée des deux isoformes durant un effort musculaire intense de courte durée (Chen, Z, et al. 2000; Hayashi, T, et al. 2000). Par ailleurs, d'autres travaux ont révélé une activation significative conjointe des sous-unités a1 et a2 dans le muscle épitrochlearis isolé en réponse à la contraction induite par stimulation électrique (Ai, H, et al. 2002; Fryer, L, et al. 2000; Hayashi, T, et al. 2000; Musi, N, et al. 2001). Il est cependant important de considérer que ces mesures d'activation sont effectuées in vitro et ne sont donc pas représentatives des mécanismes d'activation allostérique de l'AMPK. L'ensemble de ces évidences suggèrent donc que l'amplitude et la durée de la contraction déterminent le niveau d'activité des différents isoformes de l'AMPK, celui-ci étant dépendant des niveaux d'AMP, d'ATP, de créatine phosphate, mais aussi du contenu en glycogène. Un des mécanismes proposés veut que durant les premières minutes de contraction, l'activité de l'AMPK soit régulée allostériquement par le contenu en AMP, ATP et CP et que sa régulation subséquente soit dépendante du contenu en glycogène (Stephens, TJ, et al. 2002).

L'implication de l'AMPK dans la stimulation du transport du glucose induite par la contraction musculaire a été rigoureusement confirmée par une étude utilisant des souris transgéniques exprimant une forme dominante négative de la sous-unité a-2 de l'AMPK au niveau du muscle squelettique et cardiaque (Mu, J, et al. 2001). Chez ces souris, l'effet de la contraction musculaire in vivo et in vitro sur la captation du glucose est réduit de moitié dans les muscles EDL et soléaire (in vivo). De plus, l'inhibition du transport du glucose dans le muscle EDL contracté in situ s'est vue attribuable à une diminution de la translocation de GLUT4 à la surface cellulaire. Cette importante étude démontre d'une part que l'AMPK est impliquée dans la cascade intracellulaire par laquelle la contraction musculaire active la captation du glucose, mais également qu'une autre voie de signalisation, indépendante de l'AMPK, contribue à cet effet.

Le 5'aminoimidazole-4-carboxamide 1 b-D-ribofuranoside, mieux connu sous le nom de AICAR, est un analogue de l'adénosine qui a été proposé comme agent mimétique de la contraction musculaire sur le transport du glucose au niveau du muscle squelettique. Le AICAR est transporté à l'intérieur de la cellule par des transporteurs de nucléosides où il est transformé dans le cytoplasme en ZMP par l'adénosine kinase. Le ZMP est un analogue de l'AMP qui mime les effets de l'AMP en amplifiant la phosphorylation de l'AMPK par l'AMPKK (Corton, JM, et al. 1995) et en activant allostériquement l'AMPK (Corton, JM, et al. 1995; Henin, N, et al. 1996).

Plusieurs études ont révélé que le AICAR, tout comme la contraction musculaire, produisait une augmentation de l'activité de l'AMPK et du transport du glucose (Bergeron, R, et al. 1999), parallèlement à une stimulation de la translocation de GLUT4 au niveau du muscle squelettique (Hayashi, T, et al. 1998; Kurth-Kraczek, EJ, et al. 1999) et cardiaque (Russell, RR, 3rd, et al. 1999). Contrairement à l'insuline, ces travaux ont rapporté que la contraction musculaire et le AICAR n'avaient pas d'effets additifs sur le transport du glucose dans le muscle squelettique. De plus, leurs effets sont insensibles à la wortmannine, un inhibiteur de la PI-3 kinase. Ces données suggèrent donc que ces deux stimuli utilisent une même voie de signalisation intracellulaire, indépendante de la PI-3 kinase, pour stimuler le transport du glucose. De plus, l'effet du AICAR sur le transport du glucose dans le muscle EDL est complètement inhibé chez des souris transgéniques exprimant la forme dominante négative de l'AMPK a-2 dans le muscle, suggérant ainsi que le transport musculaire du glucose stimulé par le AICAR est dépendant de l'activation de l'AMPK (Mu, J, et al. 2001).

De nombreux travaux ont démontré que le AICAR stimulait l'activité de l'AMPK et le transport du glucose au niveau des muscles de rongeurs (Aschenbach, WG, et al. 2002; Bergeron, R, et al. 1999; Wojtaszewski, J, et al. 2002). De plus, certaines données suggèrent que ces effets pourraient varier selon le type de fibres musculaires étudié et selon l’utilisation de modèles in vivo ou in vitro. Des études in vitro chez le rat ont démontré que le AICAR induit une augmentation sélective du transport du glucose et de l'activité de l'AMPK au niveau des myofibres glycolytiques de type II, comme l'épitrochlearis (Bergeron, R, et al. 1999; Hajduch, E, et al. 1998; Hayashi, T, et al. 1998; Musi, N, et al. 2001) et non au niveau du muscle soléaire enrichi en fibres oxydatives de type 1 (Ai, H, et al. 2002; Mu, J, et al. 2001; Musi, N, et al. 2001). Néanmoins, des études semblent contradictoires à cette observation (Fryer, L, et al. 2000; Sakoda, H, et al. 2002). Des études chez la souris ont toutefois démontré un effet du AICAR sur le transport du glucose dans le muscle soléaire (Balon, T and Jasman, A 2001). Contrairement au rat, le muscle soléaire de souris est plus enrichi en fibres glycolytiques de type II. De façon générale, ces observations proposent donc que les fibres musculaires de type II sont davantage sensibles à l'effet du AICAR que les myofibres de type I. Par ailleurs, l'absence d'activation de l'AMPK par le AICAR dans le muscle soléaire isolé peut possiblement être attribuable à une sensibilité accrue du muscle soléaire au glycogène comparativement au muscle EDL puisqu'il a été démontré que la contraction musculaire induit une augmentation de l'activité de l'AMPK seulement dans le muscle soléaire pauvre en glycogène (Derave, W, et al. 2000).

Contrairement aux études in vitro, il a été établi que l'infusion ou l'injection de AICAR chez les rongeurs provoque une augmentation de la captation du glucose et de l'activité de l'AMPK tant au niveau des muscles enrichis en fibres de type II qu'au niveau des myofibres de type I (Bergeron, R, et al. 1999; Paulsen, SR, et al. 2001), l'activité de l'AMPK étant plus élevée au niveau des myofibres de type II (Wojtaszewski, J, et al. 2002).

Au niveau cellulaire, le AICAR est transformé en ZMP dans le cytoplasme de la cellule par l'adénosine kinase. Puisque la dégradation du AICAR peut générer différents métabolites comme le ZDP, le ZMP et le ZTP, et que le ZTP peut-être lui-même métabolisé en AMP, plusieurs groupes se sont intéressés à déterminer la spécificité du ZMP associée à l'activation de l'AMPK. Ainsi, il a été démontré que le ZMP pouvait mimer les effets de l'AMP indépendamment de celui-ci en activant directement l'AMPK purifiée de façon allostérique en plus de causer une réactivation de l'AMPK déphosphorylée (Corton, JM, et al. 1995; Weekes, J, et al. 1993). D'autres travaux démontrent aussi que le degré d'activation de l'AMPK hépatique induit par le ZMP est comparable mais non additif à celui de l'AMP dans des conditions saturables, ce qui suggère que le ZMP et l'AMP partage__ le même site de liaison sur l'AMPK (Henin, N, et al. 1996). De plus, on a observé que la concentration intracellulaire de ZMP suite au traitement avec AICAR était 50 fois supérieure à celle de l'AMP dans le muscle isolé, proposant un rôle prédominant du ZMP dans l'activation de l'AMPK dans ces conditions (Ai, H, et al. 2002). Parallèlement, les résultats de certains travaux montrent que le AICAR ne perturbe pas de façon importante le contenu en ATP, AMP, ADP, ZDP et ZTP dans les hépatocytes en culture (Corton, JM, et al. 1995) et suite au traitement in vivo avec le AICAR au niveau du muscle squelettique de rat (Bergeron, R, et al. 1999; Holmes, BF, et al. 1999; Merrill, GF, et al. 1997; Wojtaszewski, J, et al. 2002). Ces observations suggèrent donc que l'activation de l'AMPK par le AICAR est spécifiquement régulée par le ZMP et ne peut être tributaire de la variation dans les concentrations de nucléotides.

D'autre part, certains auteurs ont soulevé l'hypothèse que le ZMP pourrait activer d'autres enzymes régulées par l'AMP et ainsi induire des effets non spécifiquement reliés à l'activation de l'AMPK et à son rôle dans le transport du glucose. Ainsi, il a été démontré que le ZMP augmente l'activité de l'enzyme glycogène phosphorylase dans le muscle et dans le foie (Young, ME, et al. 1996) et inhibe la fructose 1-6 biphosphatase hépatique, menant respectivement à une activation de la glycogénolyse et une inhibition de la néoglucogénèse hépatique (Vincent, MF, et al. 1991). Cependant, une étude récente réalisée dans le muscle squelettique s'oppose à la contribution non-spécifique du ZMP, via l'activation de la glycogène phosphorylase, dans l'effet stimulateur du AICAR sur le transport du glucose in vivo (Aschenbach, WG, et al. 2002). En effet, il a été observé que le traitement in vitro avec le AICAR induisait une augmentation du transport du glucose et de la production de lactate mais aucune activation de la glycogène phosphorylase. Bien que l'activité de cette enzyme soit augmentée in vivo, ceci suggère donc que le transport du glucose et la relâche de lactate stimulés par le AICAR sont davantage expliqués par l'entrée de glucose qui est ensuite métabolisé par la glycolyse que par une augmentation de la glycogénolyse pouvant être causée par le ZMP via un effet sur la glycogène phosphorylase. Ceci supporte donc l'idée que le transport du glucose stimulé par le AICAR est peu influencé par les effets non-spécifiques du ZMP.

Puisque le AICAR est un composé analogue de l'adénosine et que l'AMP peut être convertie en adénosine, il a été suggéré que ce nucléotide pourrait réguler l'augmentation du transport du glucose stimulé par le AICAR. En effet, certaines études ont démontré que l'augmentation de la production d'adénosine durant la contraction musculaire pourrait potentialiser la stimulation du transport du glucose induite par ce stimulus (Han, DH, et al. 1998). Cependant, des résultats récents montrent qu'un antagoniste du récepteur de l'adénosine, la théophylline, ne provoque aucune diminution du transport du glucose activé par le AICAR (Bergeron, R, et al. 1999). De plus, puisque les niveaux d'AMP ne semblent pas varier suite à l'infusion de AICAR, il apparaît improbable que la concentration d'adénosine augmente (Merrill, DC, et al. 1999). Ces évidences suggèrent donc que l'adénosine ne contribue pas de façon importante à l'augmentation du transport du glucose stimulé par le AICAR.

Des études récentes ont indiqué que le contenu en glycogène musculaire, et donc le statut nutritionnel, pouvait réguler le transport du glucose et l'activité de l'AMPK en réponse à la contraction musculaire. Dans une première étude, des rats ayant un contenu en glycogène musculaire faible et élevé ont permis de démontrer qu'au niveau des fibres glycolytiques de type II, la contraction activait le transport du glucose et l'AMPK de façon plus importante chez les rongeurs dont le contenu en glycogène musculaire était faible comparativement au groupe dont le contenu était élevé (Derave, W, et al. 2000). Au niveau des fibres oxydatives de type I, la contraction a induit une augmentation de la captation du glucose et de l'activité de l'AMPK seulement dans les muscles pauvres en glycogène. Toutefois, la contraction a induit une augmentation du transport du glucose dans le muscle soléaire enrichi en glycogène sans aucune activation de l'AMPK. Ce rôle régulateur du glycogène sur l'activité de l'AMPK a d'ailleurs été supporté par des travaux démontrant que la contraction in vitro stimule davantage l'activité de l'AMPK dans divers types de muscles de rats à jeun comparativement aux rats nourris (Ai, H, et al. 2002). De plus, on a observé une atténuation de l'activation de l'AMPK dans le muscle épitrochlearis isolé enrichi en glycogène (Kawanaka, K, et al. 2000). Ces données ont été confirmées chez l'humain par une étude indiquant que l'abondance de glycogène musculaire prévient l'augmentation de l'activité de l'AMPK durant un exercice intense (Stephens, TJ, et al. 2002). De plus, l'augmentation du transport du glucose observée en absence d'activation de l'AMPK au niveau des myofibres oxydatives de type I enrichies en glycogène suggère que l'AMPK n'est pas essentielle à la stimulation du transport du glucose par la contraction et qu'une voie indépendante de l'activation de l'AMPK contribue à l'augmentation du transport du glucose dans ce type de muscle. Une étude utilisant des souris transgéniques exprimant une forme dominante négative de l'AMPK a-2 supporte cette dernière conclusion puisque chez ces souris, l'effet de la contraction musculaire in vivo et in vitro sur le transport est seulement réduit de moitié dans les muscles EDL et soléaire (in vivo) (Mu, J, et al. 2001).

Tout comme pour la contraction musculaire, la quantité de glycogène musculaire semble dicter l'activation de l'AMPK suite au traitement par le AICAR in vivo. En effet, des résultats démontrent qu'une quantité élevée de glycogène diminue le transport du glucose et l'activation de l'AMPK a2 au niveau des fibres de type II et de type I chez les rats perfusés in situ au AICAR (Wojtaszewski, J, et al. 2002). L'ensemble de ces travaux suggèrent donc que le glycogène musculaire module l'activation de l'AMPK et le transport du glucose stimulé par la contraction musculaire ou le AICAR, mais les mécanismes régulant ces effets demeurent toutefois obscurs.

La serine/thréonine protéine kinase p38 MAPK, appartenant à une famille d'enzymes appelées MAP kinases (MAPK), figure parmi les médiateurs proposés pour stimuler l'activité intrinsèque des transporteurs de glucose en réponse à la contraction musculaire ou à l'insuline. La p38 MAPK de mammifères possède 4 isoformes, a, b, g, l, et requiert une phosphorylation simultanée de ses résidus thréonine et tyrosine pour être activée (Widmann, C, et al. 1999). Le rôle de cette kinase dans le transport du glucose a tout d'abord été mis en évidence par plusieurs groupes utilisant l'insuline comme agent activateur. En effet, on a observé une réduction du transport du glucose stimulé par l'insuline en présence d'un inhibiteur spécifique de la p38 MAPK α et β, le SB203580, mais aucune diminution parallèle de la translocation de GLUT1 dans les adipocytes 3T3-L1 (Sweeney, G, et al. 1999) ou de la translocation de GLUT4myc dans les cellules musculaires L6 en culture (Konrad, D, et al. 2001; Sweeney, G, et al. 1999). De plus, il a été observé que le SB203580 ne se liait pas aux GLUT et n'induisait aucune diminution de l'activité des différentes molécules impliquées dans la voie de signalisation insulinique (Sweeney, G, et al. 1999), suggérant un effet inhibiteur spécifique à la p38 MAPK. Au niveau des cellules musculaires, une autre étude révèle que la translocation de GLUT4 activée par l'insuline précède son activation, suggérant l'existence de deux mécanismes distincts dans la régulation du transport du glucose (Somwar, R, et al. 2001). Cette hypothèse est confirmée par une étude récente qui révèle qu'en traitant des cellules musculaires L6 avec une concentration élevée d'insuline et de glucose, on observe une augmentation du transport du glucose basal mais pas de translocation de GLUT4 (Huang, C, et al. 2002). Dans cette même étude, on a observé une absence d'activation de GLUT1, une augmentation de la phosphorylation et de l'activité de la p38 MAPK et une inhibition du transport du glucose basal en présence d'un autre inhibiteur de la p38 MAPK, le SB202190, ce qui suggère que la p38 MAPK contribue à l'augmentation du transport du glucose induite par ces traitements via l'activation de GLUT4. L'importance d'une activation de GLUT4 dans l'effet stimulateur de l'insuline sur le transport du glucose est aussi supporté par l'observation que le traitement de cellules musculaires et adipeuses avec une faible dose de wortmannine, un inhibiteur de la PI-3 kinase, inhibait le transport du glucose et l'activité de la p38 MAPK α et β en réponse à l'insuline. Cependant, la faible dose de wortmannine utilisée n'était pas suffisante pour inhiber l'activité de la PI-3 kinase et la translocation de GLUT4 (Hausdorff, SF, et al. 1999; Somwar, R, et al. 2001; Somwar, R, et al. 2001). Ces derniers résultats suggèrent donc qu'un nouveau médiateur, hautement sensible à la wortmannine, mais distinct de la PI-3 kinase, régule l'activation de la p38MAPK et de GLUT4 induite par l'insuline. De plus, le traitement de cellules adipeuses avec un agent activateur de la p38MAPK, l'anisomycine, révèle une activation de la p38MAPK et du transport du glucose (Barros, LF, et al. 1997), ce qui appuie l'implication de cette kinase dans la stimulation du transport du glucose. Toutefois, certaines études sont en désaccord avec les données précédentes. En effet, on observe une absence d'inhibition du transport du glucose stimulé par l'insuline en présence de SB203580 (Kayali, A, et al. 2000) ou par la surexpression d'une forme dominante négative de la p38 MAPK (Fujishiro, M, et al. 2001) dans les adipocytes 3T3-L1 en culture. Cependant, une étude très récente alimente la controverse puisqu'il a été démontré qu'une forme dominante négative de la p38MAPK ainsi que deux nouveaux inhibiteurs de cette enzyme inhibent le transport du glucose stimulé par l'insuline sans affecter la translocation de GLUT4 (Somwar, R, et al. 2002). De façon générale, plusieurs évidences suggèrent un rôle de la p38 MAPK dans la stimulation du transport du glucose en réponse à l'insuline via l'activition intrinsèque de GLUT4.

Peu d'études ont vérifié le rôle de la p38MAPK dans l'effet stimulateur de l'exercice ou de la contraction musculaire sur la captation du glucose. Certains travaux ont démontré que l'exercice et la contraction musculaire eccentrique stimulent l'activité de la p38 MAPK (Goodyear, LJ, et al. 1996; Hayashi, T, et al. 1999; Widegren, U, et al. 1998; Wretman, C, et al. 2001) et ce, indépendamment de la PKC (Ryder, JW, et al. 2000). Plus spécifiquement, il a été démontré que la contraction musculaire et l'insuline induisaient l'activation des isoformes a et b de la p38 MAPK et que l'effet individuel de ces deux stimuli sur le transport du glucose était réduit par le SB203580 dans le muscle extensor digitorum longus (EDL) isolé (Somwar, R, et al. 2000). De façon générale, l'ensemble de ces évidences proposent donc que la p38MAPK contribue à l'augmentation du transport du glucose stimulé par la contraction musculaire via l'activation des transporteurs de glucose GLUT4.

Par ailleurs, certains travaux ont suggéré un rôle de la p38 MAPK dans la stimulation du transport du glucose induite par le AICAR. Dans les cellules Clone-9 n'exprimant que l'isoforme GLUT1, on a observé que la stimulation du transport du glucose par le AICAR est associée à une augmentation de l'activité intrinsèque de GLUT1, aucun changement dans le contenu en GLUT1 à la membrane plasmique n'ayant été observé (Abbud, W, et al. 2000). Dans ce type de cellules, on a de plus constaté que le AICAR activait la p38 MAPK et que le transport du glucose stimulé par le AICAR était inhibé par le SB203580 ou par la surexpression d'une forme dominante négative de la p38 MAPK (Xi, X, et al. 2001). Cette étude révèle également que la surexpression d'une forme constitutionnellement active de l'AMPK amène une activation de la p38MAPK, l'activation de l'AMPK n'étant toutefois pas affectée par le SB203580. Au niveau des cellules musculaires L6, on a par contre observé une absence d'inhibition du transport du glucose stimulé par le AICAR en présence de SB203580 (Chen, HC, et al. 2002). Ces évidences témoignent donc de la controverse entourant le rôle de la p38 MAPK dans l'augmentation du transport du glucose induite par le AICAR via l'activation des transporteurs de glucose.

Plusieurs travaux ont évoqué que l'insuline et la contraction musculaire stimulaient de façon additive le transport du glucose au niveau du muscle squelettique (Nesher, R, et al. 1985; Ploug, T, et al. 1987), suggérant l'implication de différentes voies de signalisation intracellulaires dans l'effet activateur de ces deux stimuli sur le métabolisme du glucose. D'autres évidences supportant cette hypothèse reposent d'une part sur le fait que la PI-3 kinase n'est pas impliquée dans l'effet activateur de la contraction musculaire sur le transport musculaire de glucose. Il a été également démontré que la contraction musculaire stimule normalement la captation du glucose chez les modèles animaux de résistance à l'insuline et chez les sujets humains insulino-résistants. L'existence d'un effet additif de l'insuline et de la contraction musculaire sur le transport musculaire de glucose est également supportée par l'observation que ces deux stimuli induisent une translocation additive de GLUT4, celui-ci étant possiblement recruté à partir de populations de vésicules distinctes sensibles à l'insuline ou à la contraction musculaire. Ces différentes évidences sont discutées dans les sections suivantes.

Chez le rat, il a été rapporté que durant l'exercice aigu sur tapis roulant et lors de la contraction musculaire stimulée in situ et in vitro, on observait aucun changement de la phosphorylation de IR, des protéines IRS-1/2, de l'activité de la PI-3 kinase associée à IRS-1/2 ou de l'activité de l'Akt/PKB (Goodyear, LJ, et al. 1995; Howlett, KF, et al. 2002; Wojtaszewski, JF, et al. 1999; Zhou, Q and Dohm, GL 1997). Cependant, certaines évidences suggèrent que l'Akt/PKB est activée par la contraction musculaire mais indépendamment de l'activation de la PI-3 kinase (Nader, GA and Esser, KA 2001; Sakamoto, K, et al. 2002), suggérant une convergence de la voie de signalisation insulinique et de celle activée par la contraction musculaire en aval de la PI-3 kinase. De plus, certains travaux indiquent que la wortmannine n'inhibe pas le transport du glucose stimulé par la contraction musculaire in vitro (Lee, AD, et al. 1995; Lund, S, et al. 1995; Yeh, JI, et al. 1995), bien qu'une étude rapporte le contraire avec la contraction musculaire stimulée in situ (Wojtaszewski, JF, et al. 1996). Cependant, étant donné que la wortmannine est un inhibiteur de la PI-3 kinase moins sélectif que le LY294002 (Hausdorff, SF, et al. 1999; Somwar, R, et al. 2001; Somwar, R, et al. 2001), les conclusions de cette dernière étude demeurent donc discutables.

Les mécanismes intracellulaires par lesquels l'insuline et la contraction musculaire exercent leur effet additif sur le transport du glucose demeurent à ce jour mal définis. En effet, il a été suggéré que l'augmentation du flot sanguin durant l'exercice contribuerait à augmenter maximalement le transport du glucose, entre autres, en augmentant la quantité d'insuline interagissant avec le muscle et ce, même si l'exercice induit une diminution de la sécrétion d'insuline (Vranic, M, et al. 1976; Wasserman, DH, et al. 1992). Suivant cette optique, il devient alors concevable qu'on observe une augmentation de l'activité des molécules de signalisation insulinique durant l'exercice. Il semble toutefois que ce ne soit pas le cas puisque plusieurs travaux démontrent que l'exercice n'induit aucune augmentation de l'activité de ces molécules (Goodyear, LJ, et al. 1995; Howlett, KF, et al. 2002; Wojtaszewski, JF, et al. 1999; Zhou, Q and Dohm, GL 1997). In vitro, les résultats sont encore plus surprenants puisque la contraction musculaire inhibe l'activité de IR et de la PI-3 kinase associée à IRS-1/2 stimulée par l'insuline (Goodyear, LJ, et al. 1995; Whitehead, JP, et al. 2000) alors que le transport du glucose et la phosphorylation de l'Akt/PKB stimulés par l'insuline ne sont pas altérés, et demeurent donc augmentés, lors de la contraction musculaire chez le rat (Whitehead, JP, et al. 2000). Ces observations suggèrent donc que durant l'exercice ou la contraction musculaire, l'insuline mobilise des molécules ou voies de signalisation différentes de celles utilisées habituellement en absence de contraction musculaire, du moins en amont de l'Akt/PKB, afin de stimuler le transport du glucose de façon additive à la contraction musculaire.

De nombreuses études utilisant différentes procédures de fractionnement membranaire de muscles ont démontré que parallèlement à une augmentation additive du transport du glucose, l'effet combiné de l'insuline et de la contraction musculaire induisait une augmentation partiellement (Lund, S, et al. 1995) ou totalement (Gao, J, et al. 1994) additive de la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique. De plus, on a observé que ces deux stimuli augmentaient de façon additive la translocation de GLUT4 au niveau des tubules-T (Ploug, T, et al. 1998). Toutefois, d'autres groupes n'ont pas observé un effet additif (Goodyear, LJ, et al. 1990) ou ont observé un effet additif partiel (Brozinick, JT, Jr., et al. 1994; Douen, AG, et al. 1990) sur le transport du glucose en présence de ces deux stimuli, et une absence d'effet additif sur la translocation de GLUT4. Les divergences de ces résultats semblent attribuables aux différentes techniques de fractionnement membranaire utilisées. De façon générale, il a été proposé que l'effet additif de l'insuline et de la contraction musculaire sur le transport du glucose pourrait être attribuable au recrutement de différentes populations de vésicules GLUT4 par ces deux stimuli.

Plusieurs évidences suggèrent qu'au niveau basal, GLUT4 réside dans plusieurs types de vésicules intracellulaires localisées dans différentes parties de la cellule et possédant des caractéristiques morphologiques et biochimiques différentes. De plus, il a été démontré que l'insuline mobilisait spécifiquement certaines de ces vésicules à la surface cellulaire alors que d'autres étaient insensibles à son action (Coderre, L, et al. 1995). Plusieurs études ont donc été effectuées afin de déterminer la nature biochimique des vésicules GLUT4 spécifiquement sensibles à l'insuline en utilisant une technique d'immunoadsorption membranaire qui permet d'isoler les vésicules GLUT4 à partir de fractions subcellulaires d'adipocytes ou de muscle squelettique. Il fut démontré qu'au niveau du tissu adipeux et du muscle squelettique, la majeure partie de l'aminopeptidase IRAP (gp160), qui est utilisée comme marqueur des vésicules GLUT4 spécialisées (VG), les récepteurs IGF-II/Man-6-P (gp 230) ainsi que la protéine SCAMPs étaient colocalisés avec GLUT4 dans ces vésicules et que ces protéines étaient mobilisées à la surface cellulaire en réponse à l'insuline (Kandror, K and Pilch, PF 1994; Kandror, KV and Pilch, PF 1994; Laurie, SM, et al. 1993; Mastick, CC, et al. 1994; Thoidis, G, et al. 1993). D'autre part, des études ont révélé que GLUT1 et GLUT4 résident dans différents compartiments intracellulaires insulino-sensibles ayant des densités et des coefficients de sédimentation similaires dans les adipocytes (Kandror, KV, et al. 1995; Lee, W, et al. 2000; Zorzano, A, et al. 1989).

Au niveau des molécules de signalisation insulinique, des travaux indiquent que l'insuline induisait une redistribution et une activation du récepteur de l'insuline au niveau des vésicules GLUT4 du muscle squelettique (Dombrowski, L, et al. 2000) et de l'adipocyte (Kublaoui, B, et al. 1995), ce qui fut cependant contredit par d'autres travaux (Kandror, KV and Pilch, PF 1998). Par ailleurs, des travaux démontrent que la PI-4 kinase ainsi que l'Akt-2 sont associées aux vésicules GLUT4 au niveau basal et que l'insuline augmente la colocalisation vésiculaire de GLUT4 et de l'Akt-2 (Calera, MR, et al. 1998; Del Vecchio, RL and Pilch, PF 1991; Kristiansen, S, et al. 1998; Kupriyanova, TA and Kandror, KV 1999).

Les protéines SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide Attachment protein REceptor) associées aux compartiments vésiculaires (v-SNAREs) ou aux compartiments de surface (t-SNAREs) ont été proposées comme jouant un rôle dans l'amarrage et la fusion des vésicules GLUT4 à la surface cellulaire. Ainsi, on a observé que les v-SNAREs VAMP-2 et VAMP-3/cellubrevine, et plus particulièrement VAMP-2 (Sevilla, L, et al. 1997), sont associées aux vésicules GLUT4 sensibles à l'insuline (Cain, CC, et al. 1992; Volchuk, A, et al. 1995). Certains travaux utilisant des toxines de clivage des VAMPs ainsi que des protéines recombinantes de fusion (GST-VAMP-2/3) ont indiqué que VAMP-2, et non VAMP-3, est essentielle à la translocation de GLUT4 stimulée par l'insuline (Cheatham, B, et al. 1996; Martin, LB, et al. 1998; Millar, CA, et al. 1999; Randhawa, VK, et al. 2000; Yang, C, et al. 2001). D'autre part, on a démontré que les protéines t-SNAREs Syntaxine-4 et SNAP-23, formant un complexe avec VAMP-2, sont essentielles à la translocation de GLUT4 induite par l'insuline dans les adipocytes (Cheatham, B, et al. 1996; Kawanishi, M, et al. 2000; Olson, AL, et al. 1997; Rea, S, et al. 1998; Tellam, JT, et al. 1997) et le muscle squelettique (St-Denis, JF and Cushman, SW 1998). En plus des protéines SNARES, des études révèlent qu'une protéine liant le GTP, Rab4, colocalise avec GLUT4 dans les VG d'adipocytes (Cormont, M, et al. 1993) et de muscle squelettique de rat (Aledo, JC, et al. 1995; Kessler, A, et al. 2000). De plus, l'expression d'une forme mutante de Rab4 ainsi que l'injection d'anticorps dirigés contre Rab4 ont permis de déterminer que cette protéine est essentiellement impliquée dans la translocation de GLUT4 insulino-sensible (Cormont, M, et al. 2001; Knight, JB, et al. 2000; Mora, S, et al. 1997; Shibata, H, et al. 1996; Vollenweider, P, et al. 1997). De façon générale, bien que l'association de certaines protéines avec les vésicules GLUT4 insulino-sensibles ait été démontrée, les rôles fonctionnels de ces associations dans l'amarrage ou la fusion, la translocation, ou le mouvement vésiculaire de GLUT4 par l'insuline sont encore peu définis.

Alors que de nombreuses études ont été réalisées afin de caractériser les différents compartiments intracellulaires sensibles à l'insuline ainsi que la régulation hormonale du mouvement intracellulaire de GLUT4, un nombre beaucoup plus restreint de travaux ont été effectués avec la contraction musculaire. Certaines évidences suggèrent que l'insuline et la contraction musculaire stimulent de façon additive le transport du glucose en recrutant GLUT4 à partir de deux différentes populations de vésicules GLUT4 (Brozinick, JT, Jr., et al. 1994; Coderre, L, et al. 1995; Douen, AG, et al. 1990; Etgen, GJ, Jr., et al. 1993; Ploug, T, et al. 1998; Sherman, LA, et al. 1996). En effet, certains ont observé que la contraction musculaire n'induit aucune diminution du contenu en GLUT4 à partir d'un compartiment intracellulaire sensible à l'insuline (Brozinick, JT, Jr., et al. 1994; Douen, AG, et al. 1990). De plus, des travaux de fractionnement membranaire du muscle squelettique ont permis d'isoler deux différents types de vésicules GLUT4 ayant des coefficients de sédimentation différents et étant distinctement sensibles à l'insuline et à l'exercice (Coderre, L, et al. 1995). L'immunoadsorption de ces vésicules a révélé une similarité dans leur composition protéique, chacune d'elles contenant les protéines IRAP et SCAMPs, mais excluant les protéines GLUT1 et cavéoline. De plus, l'effet combiné de l'insuline et de l'exercice diminue simultanément le contenu en GLUT4 et de IRAP à partir de leur vésicule respective. D'autre part, certaines évidences suggèrent que contrairement à l'insuline, la contraction musculaire induit le recrutement de GLUT4 à la membrane cellulaire à partir d'un réservoir endosomal enrichi en récepteur de la transferrine (TfR). Par une technique d'immunofluorescence à double marquage ainsi que par le fractionnement membranaire, il a été observé que l'insuline mobilisait GLUT4 à partir d'un compartiment vésiculaire ne contenant pas le TfR alors que la contraction musculaire sitmulait à la fois la translocation de GLUT4 à partir de vésicules enrichies ou non en TfR (Ploug, T, et al. 1998). Cependant, une étude démontre que l'insuline et la contraction musculaire activent la translocation de GLUT4 et de IRAP, et non du TfR, à la membrane plasmique et ce, à partir d'un même réservoir intracellulaire (Tomas, E, et al. 2001). De plus, tout comme l'insuline, l'exercice recrute GLUT4 à partir d'un compartiment associé à la v-SNAREs VAMP-2 dans le muscle squelettique humain, suggérant que ces deux stimuli recrutent GLUT4 à partir d'un même réservoir vésiculaire (Kristiansen, S, et al. 1996). Alternativement, des travaux révèlent que l'insuline, et non la contraction musculaire, stimule la translocation de GLUT4 et de Rab4 à la membrane plasmique du muscle squelettique de rat (Sherman, LA, et al. 1996). Conjointement, ces résultats suggèrent que la contraction musculaire stimule la translocation de GLUT4 d'une part à partir d'un compartiment vésiculaire insensible à l'insuline, et d'autre part, à partir d'un second réservoir vésiculaire semblable ou distinct de celui mobilisé par l'insuline. Cependant, cette conclusion demeure hypothétique et d'autres travaux seront nécessaires afin de clarifier la nature des différents compartiments vésiculaires mobilisés par l'insuline et la contraction musculaire.

* Protéines spécifiquement associées aux vésicules GLUT4 (VG) sensibles à l'insuline ou à la contraction musculaire.

Depuis plusieurs années, le mouvement intracellulaire des transporteurs de glucose GLUT4 a été considérablement étudié afin de clarifier les mécanismes par lesquels l'insuline et la contraction musculaire stimulent la translocation de GLUT4 dans les cellules musculaires et adipeuses. L'utilisation de plusieurs modèles expérimentaux visant à définir la nature des divers compartiments ainsi que la régulation de leurs interactions suite à la stimulation insulinique a conduit à la création de plusieurs modèles très complexes et encore mal définis de mouvement intracellulaire de GLUT4 via le système endosomal. Un modèle hypothétique de ces interactions est décrit à la figure 8.

Chez plusieurs espèces, le maintien de l'intégrité cellulaire et de la réponse biologique est assuré par le transport de nombreuses molécules extracellulaires vers l'intérieur de la cellule. Ce mécanisme de transport transmembranaire est réalisé grâce à l'intervention de différents mécanismes d'endocytose très complexes requérant la mobilisation de divers compartiments endosomaux. Le système endosomal comporte plusieurs compartiments membranaires qui ont été caractérisés selon des paramètres cinétiques, morphologiques, moléculaires et fonctionnels. Ceux-ci regroupent principalement les endosomes de premier ordre subdivisés en 2 sous-groupes i.e. les endosomes de triage et les endosomes de recyclage, ainsi que les endosomes tardifs et les lysosomes (Clague, MJ 1998; Geuze, HJ, et al. 1983; Sachse, M, et al. 2002).

Au niveau du muscle squelettique et des adipocytes, il a été démontré que 99 % des transporteurs de glucose GLUT4 sont séquestrés à l'intérieur de la cellule au niveau basal et qu'une certaine proportion de GLUT4 est associée au système endosomal incluant les endosomes de triage et les endosomes de recyclage (Livingstone, C, et al. 1996; Martin, S, et al. 1996; Millar, CA, et al. 1999). Par l'ablation chimique des endosomes de cellules adipeuses en utilisant un conjugué HRP lié à la transferrine, il a donc été démontré que 40 % des GLUT4 sont associés au système endosomal au niveau basal, alors qu'une seconde population de vésicules spécialisées (60 % GLUT4) sont dépourvues de marqueurs endosomaux tels que le TfR (Lampson, MA, et al. 2001; Livingstone, C, et al. 1996; Ploug, T, et al. 1998; Wei, ML, et al. 1998). De plus, la microscopie électronique au niveau du tissu adipeux a révélé que 13 % de GLUT4 appartenant à cette seconde population de vésicules est associé au réseau Trans-Golgi (TGN) et que la proportion de GLUT4 résiduelle appartient à des structures tubulo-vésiculaires représentant un compartiment spécialisé spécifiquement sensible à l'insuline (Slot, JW, et al. 1991; Slot, JW, et al. 1991). La séquestration de GLUT4 au niveau basal est supportée par le fait que le recyclage de GLUT4 à la surface cellulaire est de 5 à 10 fois inférieur à celui du TfR dans les adipocytes (Holman, GD, et al. 1994; Tanner, LI and Lienhard, GE 1987). De plus, des travaux utilisant des protéines chimériques et mutantes démontrent que certains motifs spécifiques de la partie C-terminale de GLUT4 (motif dileucine SLL) seraient responsables de sa séquestration à l'intérieur de la cellule alors que certaines séquences de sa portion N-terminale (motif FQQI) dirigeraient son endocytose (Araki, S, et al. 1996; Czech, MP, et al. 1993; Piper, RC, et al. 1993; Verhey, KJ, et al. 1993). De façon générale, l'ensemble des études cinétiques visant à définir le mouvement intracellulaire de GLUT4 suggèrent qu'au niveau basal, GLUT4 est localisé dans deux types de compartiments intracellulaires : un compartiment endosomal associé aux endosomes de triage et aux endosomes de recyclage assurant le recyclage constitutif de GLUT4 à la surface cellulaire au niveau basal, et un compartiment post-endosomal spécialisé qui est spécifiquement recruté à la surface cellulaire par l'insuline (Aledo, JC, et al. 1997; Becker, C, et al. 2001; Hashiramoto, M and James, DE 2000; Holman, GD, et al. 1994; Kandror, KV 1999; Lee, W, et al. 2000; Martin, S, et al. 1996).

Les différentes localisations intracellulaires de GLUT4 ainsi que les différentes voies de transport intracellulaires de ce transporteur de glucose témoignent de la complexité de ce processus visant à augmenter le contenu en GLUT4 à la surface cellulaire en réponse à l'insuline. Plusieurs études suggèrent que l'insuline augmente le contenu en GLUT4 à la surface cellulaire en accélérant son recyclage et son exocytose et en ralentissant son endocytose (Jhun, BH, et al. 1992; Satoh, S, et al. 1993; Yeh, JI, et al. 1995). De plus, certaines évidences suggèrent que l'insuline augmente l'exocytose de plusieurs protéines qui recyclent de façon constitutive via le système endosomal comme le TfR, le IGF-II/Man-6-PR et GLUT4 (Tanner, LI and Lienhard, GE 1987; Tanner, LI and Lienhard, GE 1989). Par ailleurs, il semblerait que l'insuline accélère le recyclage de GLUT4 à la surface cellulaire en régulant le mouvement inter-endosomal de GLUT4, ce processus étant dépendant de l'activation de la PI-3 kinase (Foster, LJ, et al. 2001). Cependant, le recrutement de GLUT4 à la surface cellulaire en présence d'insuline est beaucoup plus important que celui des protéines endosomales ou de recyclage (James, DE and Piper, RC 1994; Kandror, KV and Pilch, PF 1996), suggérant que GLUT4 est principalement mobilisé à la surface cellulaire à partir d'un compartiment non associé au système endosomal (compartiment post-endosomal). Ainsi, il a été démontré que la majeure partie des GLUT4 mobilisés à la surface cellulaire origine de la translocation du réservoir spécialisé de GLUT4 spécifiquement sensible à l'insuline (Malide, D, et al. 2000; Rodnick, KJ, et al. 1992). En accord avec cette dernière observation, on a remarqué que sous l'action de l'insuline, le contenu en GLUT4 augmente de 30 à 40 fois au niveau de la membrane plasmique de la cellule adipeuse, mais augmente seulement de 3 fois au niveau des endosomes de premier ordre (Slot, JW, et al. 1991; Slot, JW, et al. 1991), suggérant qu'une certaine partie des GLUT4 transitent au niveau du système endosomal mais qu'une proportion plus importante de GLUT4 provient d'un compartiment post-endosomal. Par l'ablation chimique des endosomes de cellules adipeuses en utilisant un conjugué HRP lié à la transferrine, une étude indique que cette ablation ne bloque pas la translocation de GLUT4 stimulée par l'insuline, mais ne fait que retarder son apparition à la surface cellulaire (Martin, LB, et al. 1998). L'ensemble de ces données suggèrent donc que le système endosomal contribue de façon indirecte, mais non essentielle, à la translocation de GLUT4 (Aledo, JC, et al. 1997; Livingstone, C, et al. 1996; Martin, S, et al. 1996; Millar, CA, et al. 1999).

Membrane plasmique

Vésicules GLUT4

spécialisées

Réservoir de GLUT4

Réseau Trans-Golgi

Endosomes de recyclage

Endosomes de triage

Endosomes tardifs

Lysosomes

CCV

CCP

GLUT 4

GLUT 1

Récepteur de la transferrine

GLUT4 destinés à la dégradation

Dynamine

Niveau basal

Stimulation insulinique

Stimulation insulinique (voie la plus probable)

Bien que plusieurs travaux ont été réalisés afin de clarifier le rôle des endosomes dans le mouvement intracellulaire de GLUT4 en présence d'insuline, un nombre très restreint d'évidences sont actuellement disponibles pour la réponse engendrée par la contraction musculaire. Les résultats les plus concluants proviennent d'une étude démontrant que la contraction musculaire induit le recrutement de GLUT4 à la membrane cellulaire à partir d'un réservoir endosomal enrichi en récepteur de la transferrine. Par une technique d'immunofluorescence à double marquage ainsi que par le fractionnement membranaire, on a observé que, contrairement à l'insuline, la contraction musculaire stimulait la translocation de GLUT4 à partir de vésicules enrichies ou non en TfR (Ploug, T, et al. 1998). Étant donné le nombre limité de données dans la littérature, d'autres études seront nécessaires afin de déterminer l'implication possible des endosomes dans le mouvement intracellulaire de GLUT4 lors de la contraction musculaire.

Le rôle du monoxyde d'azote dans le métabolisme musculaire du glucose a premièrement été proposé par l'observation que le monoxyde d'azote libéré durant l'incubation d'un muscle squelettique isolé engendre une augmentation du transport du glucose à l'état basal (Balon, TW and Nadler, JL 1994). Par la suite, il fut démontré que des donneurs de monoxyde d'azote comme le sodium nitropusside (SNP) et la spermine nonoate induisaient une augmentation de la captation de glucose dans le muscle squelettique isolé (Balon, TW and Nadler, JL 1997; Higaki, Y, et al. 2001; Young, ME, et al. 1997). Puisqu'on a observé une augmentation de la production de monoxyde d'azote durant la contraction musculaire (Balon, TW and Nadler, JL 1997), il devient donc important de clarifier le rôle possible de cette molécule dans la stimulation du transport du glucose induite par la contraction musculaire.

Le monoxyde d'azote (NO) est un gaz vasoactif qui a premièrement été nommé EDRF (endothelium derived relaxing factor). En effet, ce messager biologique a tout d'abord été décrit lors d'études effectuées au niveau du système vasculaire qui démontraient que l'action vasodilatatrice de l'acétylcholine sur les vaisseaux sanguins nécessitait la libération d'un facteur myorelaxant, l'EDRF, par les cellules endothéliales (Furchgott, RF and Zawadzki, JV 1980). Par sa nature biochimique lui conférant la capacité de franchir toutes les membranes biologiques, le monoxyde d'azote a également été reconnu comme un neurotransmitteur clé au niveau du système nerveux. Les résultats de plusieurs travaux ont également déterminé que le monoxyde d'azote régule de nombreuses autres fonctions physiologiques comme la réponse immunitaire, le processus inflammatoire, le choc septique, la mort neuronale au cours de l'ischémie, la motilité intestinale, la contraction des muscles lisses, les mécanismes cellulaires d'apprentissage et de la mémoire et l'érection via son action vasodilatatrice sur le flot sanguin (Alderton, WK, et al. 2001; Stamler, JS and Meissner, G 2001).

Le monoxyde d'azote est produit par une famille d'enzymes appelées synthases du monoxyde d'azote (NOS) qui compte à ce jour trois principaux isoformes. Ils ont été identifiés selon l'ordre et les types cellulaires où ils ont été premièrement identifiés : l'isoforme neuronal nNOS (NOS1), l'isoforme inductible iNOS (NOS2) exprimé entre autres chez les macrophages et l'isoforme endothélial eNOS (NOS3). Ces isoformes sont le produit de gènes distincts et diffèrent principalement selon leur distribution tissulaire, localisation cellulaire, mécanismes de régulation et fonctions biologiques (Voir tableau 5). De façon simplifiée, le monoxyde d'azote est produit suite à la conversion de la L-arginine en L-citrulline sous l'action des NOS qui catalysent cette réaction. Celle-ci requiert une multitude de cofacteurs comme le complexe Ca+2/calmoduline (pour les NOS dépendantes du calcium), l'oxygène, l'hème (Fe), le NADPH, la tétrahydrobioptérine (BH4) et certaines coenzymes comme la flavine mononucléotide (FMN) et la flavine adénine nucléotide (FAD). Comme molécule signalétique, le monoxyde d'azote est impliqué dans certains processus biologiques via sa liaison avec la guanylate cyclase, ce qui produit une activation de cette enzyme et une augmentation de la concentration intracellulaire de cGMP (Murad, F 1996; Schmidt, HH and Walter, U 1994). Il a également été démontré que le monoxyde d'azote régule l'activité de certaines protéines en induisant une réaction de S-nitrosylation des résidus cystéines comme au niveau de certains canaux ioniques, récepteurs, enzymes, facteurs de transcription et protéines G (Alderton, WK, et al. 2001; Stamler, JS and Meissner, G 2001). De plus, l'interaction du monoxyde d'azote avec certains dérivés de l'oxygène hautement réactifs (ex : superoxide) peut conduire à la formation de peroxynitrite et ainsi augmenter la nitration des tyrosines de certaines protéines, ce qui peut causer divers types de dommages cellulaires. Conjointement avec le cGMP, les réactions de S-nitrosylation et de nitration constituent les principaux mécanismes impliqués dans les réponses biologiques induites par le monoxyde d'azote.

eNOS est abondamment exprimée, de façon constitutive, au niveau des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, du muscle cardiaque (Balligand, JL and Cannon, PJ 1997) ainsi que dans le cytoplasme des myofibres de type I et II du muscle squelettique de rat, son niveau d'expression étant corrélé au contenu en mitochondries des myofibres (Kobzik, L, et al. 1995). Il a été suggéré que eNOS soit localisée dans les mitochondries du muscle squelettique de rat (Bates, TE, et al. 1996). Chez l'humain, certaines évidences révèlent cependant que eNOS ne serait pas exprimée dans les fibres musculaires mais serait plutôt associée à l'endothélium des vaisseaux irriguant le muscle squelettique (Frandsen, U, et al. 1996; Segal, SS, et al. 1999). Au niveau de la cellule, eNOS est surtout associée à des microdomaines spécialisés de la membrane plasmique appelés caveolae, cette localisation étant dépendante de la myristoylation et de la palmitoylation simultanée de eNOS (Shaul, PW, et al. 1996). Dans le muscle squelettique, l'activité de eNOS est régulée par le complexe Ca+2/calmoduline et par sa liaison avec la protéine endogène des caveolae, la caveoline-1 alors que la cavéoline-3 régule son activation dans le muscle cardiaque (Feron, O, et al. 1996). La liaison de la cavéoline à eNOS entraîne une inhibition de son activité qui est renversée par le complexe Ca+2/calmoduline (Ju, H, et al. 1997; Michel, JB, et al. 1997). La phosphorylation de eNOS régule également son activité. En effet, il a été observé que la phosphorylation de eNOS sur le résidu sérine 1179 induisait une augmentation de son activité (Dimmeler, S, et al. 1999; Fulton, D, et al. 1999) alors que la phosphorylation sur le résidu thréonine 495 inhibait son activation (Chen, ZP, et al. 1999). De plus, une étude suggère que la protéine Hsp90 agirait comme modulateur allostérique positif de l'activité de eNOS (Garcia-Cardena, G, et al. 1998). Physiologiquement, eNOS régule le flot sanguin et le tonus vasculaire et on a observé une augmentation de son expression par l'entraînement physique (Balon, TW and Nadler, JL 1997; Tidball, JG, et al. 1998) et l'exercice aigu (Roberts, CK, et al. 1999).

L'enzyme nNOS est principalement exprimée dans le système nerveux central et les muscles squelettique et cardiaque, et dépend de la présence du calcium pour être activée. Chez l'humain, cet isoforme est également exprimé au niveau du pancréas, de l'estomac, des poumons et de l'utérus (Kingwell, BA 2000). Cette enzyme est subdivisée en quatre sous-types soient nNOSb, nNOSg, nNOSm et nNOS-2. Le sous-type nNOSm constitue l'isoforme prédominant du muscle cardiaque et squelettique de rat (Kobzik, L, et al. 1994; Silvagno, F, et al. 1996; Xu, KY, et al. 1999). L'analyse par Northern blot a également révélée que l'ARNm de nNOSm est abondamment retrouvé dans le muscle squelettique humain, l'activité de cette enzyme étant 15 fois plus élevée dans le tissu humain que dans celui des rongeurs (Nakane, M, et al. 1993). Chez le rat, nNOS serait localisée au niveau du sarcolemme des myocytes et à la jonction neuromusculaire et l'activité de cette enzyme serait davantage corrélée au pourcentage de myofibres de type II (Kobzik, L, et al. 1994). Contrairement aux rongeurs, des études immunohistochimiques indiquent que nNOSm est localisée dans le cytoplasme des myocytes humains et ce, autant au niveau des myofibres glycolytiques qu'oxydatives (Frandsen, U, et al. 1996).

La partie N-terminale de nNOS contient un domaine unique à cette enzyme, le domaine PDZ, permettant la liaison de nNOS à la protéine a1 syntrophine et la formation subséquente d'un complexe avec la dystrophine au niveau du sarcolemme du muscle squelettique. Par analogie à la cavéoline-1 pour eNOS, l'interaction de nNOS avec la cavéoline-3 associée au complexe dystrophine induit une inhibition de son activité (Venema, VJ, et al. 1997). Ce type d'interaction avec le complexe dystrophine confère donc à nNOS un rôle possible dans la neurotransmission au niveau de la jonction neuromusculaire (Minatel, E, et al. 2001; Ribera, J, et al. 1998). L'activité de nNOS est également contrôlée par sa phosphorylation sur le résidu sérine 847 par la kinase dépendante de la calmoduline (CAM-K) et par l'interaction avec la protéine Hsp90, menant respectivement à une inhibition et à une stimulation de l'activité de nNOS (Bender, AT, et al. 1999; Komeima, K, et al. 2000). De plus, certains inhibiteurs endogènes comme le PIN (Jaffrey, SR and Snyder, SH 1996) et le CAPON (Jaffrey, SR, et al. 1998) moduleraient l'activité de nNOS. D'autre part, l'activité de nNOS et la production de cGMP et de monoxyde d'azote sont augmentées par la contraction musculaire in vivo et in vitro. De plus, on a observé une augmentation de l'expression de nNOS par l'entraînement physique (Balon, TW and Nadler, JL 1997; Lau, KS, et al. 1998; Tidball, JG, et al. 1998), l'exercice aigu (Roberts, CK, et al. 1999) et avec le vieillissement (Capanni, C, et al. 1998). Alternativement, une inhibition de son expression est observée suite à la dénervation (Tews, DS, et al. 1997).

Des travaux proposent que le monoxyde d'azote affecte les propriétés contractiles du muscle squelettique en inhibant la force de contraction via un mécanisme dépendant du cGMP et de l'activité de nNOS (Kobzik, L, et al. 1994). Cependant, les données actuelles à ce sujet sont très contradictoires. De plus, l'impact de ces effets semble être peu important puisque l'activité de la guanylate cyclase au niveau du muscle squelettique est relativement faible comparativement aux autres tissus (Katsuki, S, et al. 1977). D'autre part, on a suggéré un rôle de nNOS dans le contrôle du flot sanguin. Chez des souris déficientes en dystrophine (souris mdx) où l'expression de nNOS est grandement réduite, on a remarqué une diminution de la vasodilatation des artérioles durant la contraction musculaire chez ces souris transgéniques comparativement aux souris contrôles (Lau, KS, et al. 1998).

iNOS est le seul isoforme des NOS dont l'expression tissulaire requiert l'action de certains stimuli d'où son appellation d'isoforme inductible. Toutefois, certains travaux chez l'humain et le rongeur ont révélé qu'une très faible quantité de iNOS serait retrouvée de façon constitutive dans le muscle squelettique (Boczkowski, J, et al. 1996; el-Dwairi, Q, et al. 1998; Kapur, S, et al. 1997; Park, CS, et al. 1996). L'expression de iNOS est induite par l'insuffisance cardiaque chronique (Hambrecht, R, et al. 1999; Riede, UN, et al. 1998), le choc septique (Moncada, S, et al. 1991) l'obésité et le diabète de type 2 (Perreault, M and Marette, A 2001) par l'entremise de certaines molécules impliquées dans la défense immunitaire et la réaction inflammatoire comme les cytokines TNFa, IL-1 et IL-6, interféron g (Boczkowski, J, et al. 1996; el-Dwairi, Q, et al. 1998) et par l'endotoxine LPS des bactéries (Bedard, S, et al. 1997; Kapur, S, et al. 2000; Liu, S, et al. 1993; Salter, M, et al. 1991). Tout comme pour nNOS, on a observé que iNOS est localisée au niveau du sarcolemme du muscle squelettique de souris et est associée à la cavéoline-3 (Gath, I, et al. 1999).

Plusieurs évidences ont rapporté que l'action du monoxyde d'azote sur le métabolisme du glucose est versatile, attribuant ainsi un rôle négatif ou positif de ce médiateur qui varie en fonction de son niveau de production. En effet, il a été rapporté qu'une production considérable de monoxyde d'azote comme celle induite lors de l'endotoxinémie ou observée dans les cas d'obésité et de diabète, pouvait avoir des effets délétères sur le métabolisme du glucose en causant une résistance à l'insuline dans le muscle isolé et dans les cellules musculaires en culture (Bedard, S, et al. 1997; Kapur, S, et al. 1997). Cependant, certaines évidences suggèrent que lorsque produit en concentration physiologique, le monoxyde d'azote peut jouer un rôle positif dans les effets métaboliques de l'insuline et de la contraction musculaire sur la captation musculaire de glucose, particulièrement via son action vasculaire.

Dans le muscle squelettique, il a été suggéré que le monoxyde d'azote pourrait être impliqué dans la modulation de l'action de l'insuline sur la captation du glucose et ce, via une augmentation du flot sanguin (in vivo) (Baron, AD 1994). En effet, certaines études chez le rat ont tout d'abord démontré que le traitement des muscles EDL et soléaire isolés avec des inhibiteurs compétitifs des NOS, le L-NAME et le L-NMMA, n'induisait aucune diminution du transport du glucose stimulé par l'insuline (Balon, TW and Nadler, JL 1997; Roy, D, et al. 1998). Ces résultats suggéreraient donc que le monoxyde d'azote ne contribue pas à l'augmentation du transport du glucose stimulé par l'insuline in vitro. D'autre part, plusieurs travaux ont proposé que l'effet stimulateur de l'insuline sur le transport musculaire de glucose pourrait être en partie attribuable à une relâche de monoxyde d'azote induite par eNOS associé à l'endothélium vasculaire. La relâche de monoxyde d'azote par eNOS induirait une augmentation du flot sanguin ce qui contribuerait à augmenter le transport du glucose dans les tissus insulino-sensibles en augmentant la disponibilité du glucose et de l'insuline au niveau des muscles squelettiques (Baron, AD 1996). Ainsi, il a été démontré que l'insuline cause une vasodilatation des artérioles et augmente le flot sanguin chez le rat et l'humain (Baron, AD 1994; Baron, AD, et al. 1995; Pitre, M, et al. 1996). Ces effets ont été démontrés comme étant dépendants de la relâche de monoxyde d'azote par l'endothélium (Chen, YL and Messina, EJ 1996; Steinberg, HO, et al. 1994). De plus, l'insuline stimule la phosphorylation et l'activation de eNOS et la relâche de monoxyde d'azote dans des cellules transfectées avec eNOS (Montagnani, M, et al. 2001). Alternativement, il a été démontré par la technique du clamp euglycémique/hyperinsulinémique que le L-NAME causait une inhibition du transport du glucose au niveau de l'organisme entier ainsi que dans le muscle squelettique et le tissu adipeux de rat (Roy, D, et al. 1998), et serait associé à une diminution de l'activité NOS dans le muscle squelettique. Ces résulats ont été supportés par des études chez l'humain qui démontrent que l'infusion intrafémorale de L-NAME cause une diminution du flot sanguin et du transport musculaire du glucose stimulé par l'insuline durant le clamp euglycémique/hyperinsulinémique (Baron, AD, et al. 1996; Baron, AD, et al. 1995). Un rôle du monoxyde d'azote dans l'augmentation du transport du glucose stimulé par l'insuline a de plus été confirmé par des travaux démontrant que la déficience en eNOS chez des souris entraînait une résistance hépatique et périphérique à l'insuline (Shankar, RR, et al. 2000). De façon générale, l'ensemble de ces données proposent un rôle du monoxyde d'azote dans les effets hémodynamiques de l'insuline sur le transport musculaire du glucose. Toutefois, le monoxyde d'azote, lorsque produit en concentration physiologique, ne semble pas être impliqué de façon directe dans la voie de signalisation par laquelle l'insuline exerce son action sur le métabolisme du glucose.

Plusieurs observations dans la littérature suggèrent que le monoxyde d'azote pourrait jouer un rôle dans l'effet stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du glucose dans le muscle squelettique. Le mécanisme d'action du monoxyde d'azote peut d'une part être attribuable à un effet direct au niveau cellulaire, par exemple via la voie de signalisation du cGMP, ou à un effet indirect via l'augmentation du flot sanguin. En effet, on a démontré qu'au niveau basal et durant la contraction musculaire du muscle EDL isolé, il y avait une augmentation de la production de monoxyde d'azote et que le transport du glucose et la production de NO était inhibé par le L-NAME ou par le L-NMMA dans ces conditions (Balon, TW and Nadler, JL 1997). Ces données ont été confirmées par des travaux indiquant que l'augmentation du transport du glucose induite par l'exercice sur tapis roulant était inhibée en présence de L-NAME dans le muscle squelettique de rat (Roberts, CK, et al. 1997). Cette dernière étude démontre également que cet effet inhibiteur du L-NAME était attribuable à une diminution de la translocation de GLUT4 à la surface cellulaire, suggérant une implication directe du NO dans la voie de signalisation intracellulaire par laquelle la contraction musculaire active la translocation de GLUT4 et la captation du glucose. Chez l'humain, l'infusion de L-NAME entraîne une diminution de la captation musculaire du glucose durant l'exercice en absence de changement du débit sanguin fémoral (Bradley, SJ, et al. 1999). Par l'utilisation de différentes techniques de mesure, d'autres groupes ont observé une diminution (Dyke, CK, et al. 1995; Gilligan, DM, et al. 1994; Hickner, RC, et al. 1997) ou une absence d'effet (Radegran, G and Saltin, B 1999; Wilson, JR and Kapoor, S 1993) de l'inhibition des NOS sur le flot sanguin fémoral durant l'exercice chez l'humain. D'autre part, des études révèlent une absence d'inhibition de la captation du glucose en présence d'inhibiteurs des NOS en réponse à la contraction musculaire des muscles épitrochlearis (Etgen, GJ, Jr., et al. 1997) ou EDL et soléaire (Higaki, Y, et al. 2001) isolés. Ces résultats ont également été observés dans ces mêmes muscles durant l'exercice chez la souris (Rottman, JN, et al. 2002) et le rat (Higaki, Y, et al. 2001). De plus, aucune augmentation du cGMP n'a été notée durant la contraction musculaire du muscle épitrochlearis isolé (Etgen, GJ, Jr., et al. 1997) alors qu'une autre étude a rapporté une augmentation du cGMP dans le muscle EDL contracté in vitro (Lau, KS, et al. 1998). Ces données reflètent un rôle controversé du monoxyde d'azote et du cGMP dans le transport du glucose stimulé in vivo par l'exercice ou in vitro par la contraction musculaire de muscles isolés.

L'effet reconnu de la contraction musculaire sur l'activation des NOS a soulevé l'hypothèse que l'AMPK, un médiateur clé de l'effet de la contraction musculaire sur le transport du glucose, pourrait être impliquée dans cette activation. En effet, des résultats récents démontrent que les NOS peuvent être phosphorylées et activées par l'AMPK. Ainsi, une étude effectuée au niveau du coeur de rat indique que l'AMPK co-immunoprécipite avec eNOS et qu'in vitro, l'AMPK phosphoryle eNOS sur le résidu sérine 1177, menant ainsi à une activation de eNOS en présence de Ca+2/calmoduline (Chen, ZP, et al. 1999). De plus, une seconde étude chez le rat a démontré que l'exercice aigu induit une activation parallèle de l'AMPKa1 et a2 et de nNOS m, suggérant que l'AMPK mène à l'activation de nNOS m bien qu'aucune activation directe n'ait été démontrée (Chen, Z, et al. 2000). À ce jour, une seule étude a vérifié le rôle du monoxyde d'azote sur le transport du glucose stimulé par le AICAR, un agent activateur de l'AMPK (Fryer, L, et al. 2000). Ainsi, il a été observé que l'AMPK activée par le AICAR induisait la phosphorylation de eNOS et de nNOS in vitro. De plus, l'activation de l'AMPK par le AICAR a induit une augmentation de l'activité des NOS dans les cellules musculaires H-2Kb de souris. Cette lignée cellulaire provient de muscles de souris transgéniques hétérozygotes pour le gène tsA58 qui permet la génération de cellules immortelles et dont la transcription est régulée par le promoteur H2K-b. Suite au traitement avec un inhibiteur des NOS, le L-NAME, ils ont observé une diminution du transport du glucose activé par le AICAR dans ces cellules, mais également au niveau des muscles EDL et soléaire isolés. De plus, on a observé une inhibition de l'effet du AICAR sur le transport du glucose par un agent inhibiteur de la guanylate cyclase et de la production de cGMP, le LY83583. Ces résultats suggèrent donc que le transport du glucose stimulé par le AICAR est dépendant de l'activation des NOS et du cGMP dans les cellules H2K-b. Cependant, d'autres travaux seront nécessaires afin de valider le rôle du monoxyde d'azote et du cGMP dans l'effet activateur du AICAR sur le transport du glucose dans le muscle squelettique in vivo.

Par ailleurs, des études suggèrent que le monoxyde d'azote stimule une voie de signalisation différente de celle activée par l'insuline ou la contraction musculaire pour augmenter la captation musculaire de glucose. En effet, des travaux ont rapporté que des donneurs exogènes de monoxyde d'azote comme le sodium nitroprusside (SNP) ou la spermine nonoate pouvaient augmenter le transport basal du glucose et la translocation de GLUT4 au niveau du muscle squelettique isolé et ce, indépendamment de l'effet de l'insuline et de la contraction musculaire (Etgen, GJ, Jr., et al. 1997; Higaki, Y, et al. 2001; Roberts, CK, et al. 1997; Young, ME, et al. 1997). Cette affirmation se base sur des résultats démontrant que la combinaison du SNP et de l'insuline, ou du SNP et de la contraction musculaire, stimule de façon additive le transport du glucose dans le muscle EDL isolé (Higaki, Y, et al. 2001; Roberts, CK, et al. 1997). Ces études révèlent également que le transport du glucose stimulé par le SNP est indépendant du calcium et de l'activation de la PI-3 kinase mais semble dépendant de l'activation de l'AMPKa1 et non de l'AMPKa2.

De façon générale, l'ensemble des études visant à clarifier le rôle du monoxyde d'azote dans l'effet stimulateur de l'insuline et de la contraction musculaire sur le transport de glucose laissent donc croire que cette molécule, lorsque produite en concentration physiologique, est impliquée dans les effets hémodynamiques de ces stimuli sur le métabolisme du glucose in vivo. Toutefois, le rôle du monoxyde d'azote dans les effets in vitro de l'insuline et de la contraction musculaire reste encore à être clarifié.

L'objectif général de la présente thèse consistait à étudier les mécanismes intracellulaires par lesquels la contraction musculaire stimule la captation du glucose dans le muscle squelettique de rat. Dans la littérature, certaines données proposent que l'insuline et la contraction musculaire activent la translocation de GLUT4 et la captation musculaire de glucose par des voies de signalisation intracellulaires distinctes. Puisqu'il est reconnu que l'exercice stimule normalement le transport du glucose chez les modèles humains et animaux de résistance à l'insuline et de diabète de type 2, il devient donc fondamental, dans un but thérapeutique, de bien comprendre les mécanismes régulateurs de la captation du glucose en réponse à la contraction musculaire.

Puisque certaines études démontrent que l'effet combiné de ces deux stimuli induit une augmentation additive du transport du glucose dans le muscle squelettique, il a été proposé que l'insuline et la contraction active la translocation de GLUT4 à partir de populations de vésicules distinctes dans le muscle de rat. L'objectif de la première étude visait donc à vérifier cette hypothèse. Ces travaux ont été réalisés à l'aide d'une technique de perfusion insulinique couplée à un protocole de contraction par stimulation électrique in situ. À l'aide d'une technique de fractionnement membranaire mise au point dans notre laboratoire ainsi que par immunobuvardage, nous avons donc pu étudier la translocation de GLUT4 et du TfR aux deux compartiments de surface, soient la membrane plasmique et les tubules-T. La technique d'immunoadsorption membranaire nous a également permis de mieux caractériser les différentes populations de vésicules GLUT4 sensibles à l'insuline et à la contraction musculaire.

L'objectif principal de la seconde étude consistait à caractériser la translocation de GLUT4 et du TfR ainsi que la régulation du transport musculaire de glucose induits par un agent activateur de l'AMPK, le AICAR. Nous avons utilisé la technique du clamp euglycémique ainsi que le fractionnement membranaire de muscles de rat afin de déterminer l'effet du AICAR sur la translocation de GLUT4 et du TfR à la surface cellulaire. Le traitement de muscles isolés au AICAR nous a également permis de déterminer le rôle de la p38 MAPK dans la stimulation du transport du glucose en utlisant la technique de la captation du 2-désoxyglucose (2-DG) marqué couplée à des mesures d'activités enzymatiques.

Certains travaux suggèrent que le monoxyde d'azote est impliqué dans la stimulation du transport du glucose par la contraction musculaire, soit de façon directe au niveau de la voie de signalisation intracellulaire, ou soit de façon indirecte par son action vasodilatatrice sur le système vasculaire. Le dernier volet de cette thèse avait donc pour objectif de déterminer si le monoxyde d'azote jouait un rôle dans l'effet stimulateur du AICAR sur la captation musculaire du glucose in vitro et in vivo. Les expériences in vitro ont été effectuées par la technique de la captation du 2-DG marqué dans les muscles glycolytiques et oxydatifs isolés traités au AICAR et/ou au L-NAME. La technique du clamp euglycémique, le dosage de nitrites et de nitrates plasmatiques ainsi que l'injection intrapéritonéale de AICAR ont également permis d'étudier l'effet du AICAR et l'implication potentielle du monoxyde d'azote sur la captation musculaire de glucose in vivo.

Copyright Kathleen Lemieux, 2003