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Table des matières
La plupart des microorganismes synthétisent plusieurs types de polysaccharides qui peuvent être classés selon leur localisation dans la cellule. Certains se trouvent à l’intérieur de la cellule, dans le cytoplasme, où ils sont utilisés par la bactérie comme source d’énergie. D'autres sont des composants de la paroi tels que les peptidoglycanes et les acides téichoïques. Enfin, un troisième groupe de polysaccharides est excrété à l'extérieur de la cellule. Le terme "exopolysaccharide" (EPS) ou "polysaccharide exocellulaire" a été proposé par Sutherland (1972) et Cerning (1994) comme appellation générale pour ce groupe. Les microorganismes peuvent excréter deux types d'EPS. Le polysaccharide peut soit être excrété dans le milieu environnant, soit rester lié à la surface de la cellule sous forme de capsule.
Les exopolysaccharides sont impliqués dans des phénomènes aussi différents que l'adhésion de Staphylococcus epidermidis à des implants biomédicaux sous-cutanés (Dunne 2002), le colmatage des pipelines et des échangeurs de chaleur, ainsi que la formation de la plaque dentaire (De Vuyst et Degeest 1999b). La grande diversité structurale des polysaccharides microbiens témoigne de l'adaptation des microorganismes à des environnements très différents.
Selon leur composition chimique, les EPS peuvent être subdivisés en deux groupes: les homopolysaccharides et les hétéropolysaccharides. Tandis que les homopolysaccharides sont constitués d'un seul type de monomère saccharidique, les hétéropolysaccharides peuvent contenir plusieurs types de sucres. Parmi les homopolysaccharides, on retrouve les α-glucanes généralement composés des résidus de glucose liés en α-1,6 et α-1,3; comme les dextranes produits par Leuconostoc mesenteroides et les glucanes par Streptococcus mutans et Streptococcus sobrinus. Les levanes, synthétisés de Streptococcus salivarius, sont aussi des homopolysaccharides, constitués de résidus de fructose liés en β-2,6. Le groupe d'EPS le plus large et le plus diversifié est le groupe des hétéropolysaccharides qui se composent de plusieurs types d'oses constitutifs. Les hétéropolysaccharides sont formés d'unités répétitives, variables dans leur taille (de di- à octasaccharides), mais aussi d'autres groupes peuvent être présents, tels des groupements phosphate, amino ou acétyle. La production d'hétéropolysaccharides est très fréquente parmi les microorganismes et on y trouve aussi bien des souches d'un intérêt médical comme Escherichia coli, Salmonella spp. ou Enterobacter spp. que des bactéries lactiques.
Des bactéries productrices d'EPS ont été identifiées dans une gamme de niches écologiques différentes et il est évident que le rôle joué par l'EPS dépend de l'environnement du microorganisme. Il a été proposé que la capacité de production d'EPS constitue une réponse directe et logique aux pressions sélectives de l'environnement (Dudman 1977). L'anabolisme d'EPS demande beaucoup d'énergie, il est donc improbable qu'une bactérie utilise autant d'énergie et de substrat sans en tirer un avantage. L’importance des EPS pour la cellule ne semble pas être très grande si on considère les bactéries in vitro. Par contre, sous des conditions naturelles, ce qui signifie des conditions fortement concurrentielles, les EPS semblent donner aux bactéries un avantage compétitif et leur permettre de se maintenir (Cerning 1994). La prolifération des microorganismes ne semble pas être affectée par la présence où l’absence d’une capsule. L'enlèvement mécanique ou enzymatique de la capsule polysaccharidique n'affecte pas négativement la croissance cellulaire in vitro et des mutants non-producteurs d'EPS peuvent apparaître spontanément. En général, les bactéries productrices d’EPS ne sont pas capables de cataboliser les EPS qu’elles ont produits. Ainsi, les EPS ne semblent pas jouer le rôle d’une source d’énergie quoique dans certains cas, une dégradation du polymère a été observée (Cerning 1994).
Le rôle des EPS pour la cellule le plus souvent proposé est de nature protectrice vis à vis de son environnement. La capacité de s'enrober dans une couche d'EPS avec un forte teneur en eau la rend plus résistante à la dessiccation et à la déprédation des protozoaires. La nature anionique de la couche d'EPS autour de la cellule peut aider à capturer des minéraux essentiels et des nutriments. Ainsi, un rôle écologique de l'EPS des cyanobactéries semble être le recyclage des métaux multivalents comme le Mn2+.
De plus, une couche d'EPS autour de la cellule influence significativement la diffusion de différentes molécules aussi bien vers l'extérieur ou vers l'intérieur de la cellule. Ainsi, des agents anti-microbiens peuvent plus difficilement l'atteindre (Whitfield 1988). La production d'EPS a conféré à une souche de Lactococcus lactis une tolérance augmentée envers le cuivre, la nisine et le lysozyme (Looijesteijn et al. 2001). Une autre fonction des EPS pourrait être de protéger les cellules contre la phagocytose. Il semble qu’il existe une relation entre l’encapsulation de la bactérie et les phénomènes de virulence. En augmentant l’hydrophobicité de la surface bactérienne, la capsule diminue sa disposition à être absorbée par les neutrophiles.
Dans la littérature, il existe des données contradictoires en ce qui concerne la relation entre les EPS et la résistance phagique. Bien qu’il semble que la capsule ait la fonction de protéger la cellule, les bactériophages actifs sur les souches encapsulées sont généralement spécifiques pour les polysaccharides de la capsule. Valyasevi et al. (1994) ont montré que les polysaccharides de la paroi des souches de L. cremoris KH et L. lactis C2 favorisent l'adsorption des bactériophages Kh et sK1, respectivement. D'autre part, la production d'un EPS capsulaire confère à L. lactis MG1614 contenant le plasmide pNZ4030 codant pour la production d'EPSune résistance accrue envers le bactériophage ML3 (Looijesteijn et al. 2001).
Dans l'environnement naturel, les micro-organismes se trouvent souvent en haute densité cellulaires dans un biofilm. La production d'un glycocalyx, qui est composé principalement d'EPS, est essentielle pour la formation d'un biofilm. C'est l'EPS qui rend la bactérie capable de s'attacher aux surfaces et qui protège contre les surfactants et même les anti-biotiques (O'Toole et al. 2000a). De plus, si un biofilm est composé de plusieurs souches, comme c'est le cas par exemple dans les intestins, les produits métaboliques d'une souche peuvent servir comme substrat pour une autre et la capacité de s'attacher d'une cellule peut procurer des sites d'attachement à d'autres (Dunne 2002). La capacité de s'attacher n'est toutefois pas toujours avantageuse pour l'homme et peut occasionner des pertes économiques considérables causées par l'obstruction des conduits d'écoulement des fluides, des filtres ou des échangeurs de chaleur (Bryers 1993). Parfois, la destruction corrosive causée par des biofilms bactériens peut être une source inépuisable de profit économique, comme on peut le constater après une visite chez le dentiste.
Les polysaccharides d'origine microbienne sont toujours en compétition dans les applications avec d'autres polymères d'origine naturelle ou synthétique. Souvent les propriétés physiques et écologiques des EPS sont supérieures mais les polysaccharides d'autres origines sont presque toujours meilleur marché à produire. C'est pourquoi les EPS doivent avoir un avantage majeur, comme par exemple un bénéfice pour la santé du consommateur, afin d'arriver à percer sur le marché. En général, les polymères d'origine microbienne sont des produits uniformes et purs. Dans le cas de la cellulose bactérienne, produite par exemple par Acetobacter xylinum, ces caractéristiques permettent de produire des membranes acoustiques de grande fermeté et ainsi de soutenir avec succès la concurrence de la cellulose végétale. Une autre stratégie est de donner au polymère une valeur ajoutée par une modification chimique de sa structure. Ainsi, le produit trouve un champs d'application spécifique comme c'est le cas pour Sephadex®, un dérivé du dextrane.
Le curdlane est un 1,3-β-glucane d'une taille moléculaire d'environ 74 kDa produit par les bactéries du genre Agrobacterium et Rhizobium. Il est soluble dans de l'eau froide et forme un gel faible après chauffage au dessus de 55°C. La fermeté du gel est augmentée avec un chauffage à plus haute température. Ces gels ont des propriétés se situant entre l'élasticité de la gélatine et la fragilité de l'agar et ils montrent une bonne capacité de rétention d'eau. À cause de ces propriétés, le curdlane est utilisé au Japon pour améliorer et modifier la texture des aliments comme le tofu, les pâtes de poisson et les gels de fèves (Sutherland 1998).
Le pullulane est un α-D-glucane avec des liaisons α-1,6 linéaires, incluant des molécules de maltotriose et maltotétraose liées α-1,4, et ayant une très bonne solubilité dans l'eau ainsi qu'en présence d'ions. Ce polysaccharide, synthétisé par Aureobasidium pullulans, est utilisé au Japon comme film d'emballage alimentaire. Une solution du polymère peut être appliquée directement sur l'aliment et former une couche sans odeur et sans goût (Sutherland 1998).
Le gellane est un polymère linéaire de 500 kDa, composé d'une unité répétitive de quatre monomères avec des groupements O-acétyle et glycéryl. Produit par Sphingomonas paucimobilis, il forme dans sa forme native des gels faibles, élastiques et thermoréversibles. Il peut former des gels avec une vaste gamme de propriétés par un contrôle du degré de l'acylation. Ce polymère est permis comme additif alimentaire aux États Unis et en Europe et commercialisé sous le nom de Kelogen® et Gelrite®. Le gel est caractérisé par une bonne saveur et est stable sur une vaste gamme de valeurs de pH. Ce polymère est aussi utilisé pour remplacer l'agar dans les milieux de culture microbiologiques et il est utilisé comme agent gélifiant dans des produits cosmétiques (Sutherland 1998).
Le xanthane est sans doute le vaisseau amiral parmi les EPS commercialisés et il est permis comme additif alimentaire aux États Unis et en Europe depuis longtemps. Il est synthétisé par Xanthomonas campestris et se compose d'une unité répétitive pentasaccharidique, une épine dorsale cellulosique avec une ramification trisaccharidique contenant le mannose, l'acide gluconique, l'acétate et le pyruvate. Le degré de ramification et d'acylation peut différer selon la souche productrice et donner au produit des caractéristiques différentes. En général, le xanthane se dissout très bien dans l'eau et ses solutions sont pseudoplastiques. Il peut être utilisé dans une vaste gamme d'aliments, car il est compatible avec la plupart des autres ingrédients alimentaires, tel que les protéines, les lipides et les autres polysaccharides. De plus, il est stable dans des conditions acides, ce qui est important dans plusieurs produits comme les vinaigrettes ou le yoghourt. Le xanthane est souvent utilisé en combinaison avec d'autres polysaccharides, comme la gomme de caroube, à cause de l'effet synergique entre ces polymères. Un mélange de deux polymères forme un gel très stable, bien que chaque polymère seul ne gélifierait pas.
Le dextrane est synthétisé par Ln. mesenteroides dans une solution de saccharose, mais il peut aussi être produit à partir d'un extrait enzymatique extracellulaire, la dextrane-sucrase. Il est utilisé, par exemple, dans la récupération assistée de pétrole, comme couche protectrice pour les graines de céréales, comme agent défloculant pour l’industrie du papier et, dans le domaine alimentaire, pour la stabilisation et l’épaississement des sirops (Cerning 1994). De plus, le dextrane est utilisé comme additif dans le plasma sanguin et pour moduler l’écoulement du sang.
Il est à noter que la présence d'EPS n'est pas souhaitée dans certains procédés de fabrication et dans certains produits. Le dextrane, par exemple, a été découvert par accident. Des mélasses transportées par bateau ont pris une consistance gélifiée et n'ont pas pu être pompées. La source de ce problème a été une croissance de Ln. mesenteroides dans les cales du bateau et la transformation du saccharose en dextrane. De plus, la production d'EPS par certaines souches de Pediococcus dans les vins et les bières et par des souches du genre Lactobacillus ou Leuconostoc sur des produits carnés emballés sous vide est non-souhaitée car elle représente une altération du produit rendant celui-ci impropre à la consommation.
En raison de leur forte production, une grande partie des recherches sur les EPS s'est concentrée sur les bactéries à Gram-negative (Ricciardi et Clementi 2000). Ces bactéries ne sont pas reconnues comme étant de grade alimentaire et le processus d'approbation de leur EPS est long. Par contre, les bactéries lactiques (LAB) sont reconnues comme GRAS (Generally Recognized As Safe) ce qui rend leurs EPS très intéressants pour l'industrie agroalimentaire (De Vuyst et al. 2001).
Les bactéries lactiques, en raison de leurs caractères technologiques, nutritionnels et éventuellement thérapeutiques, jouent un rôle central dans le traitement du lait pour obtenir des produits fermentés comme les fromages et les yoghourts. Par la fermentation, les bactéries lactiques confèrent les propriétés organoleptiques et rhéologiques particulières aux produits laitiers fermentés. Pour être classifiée comme bactérie lactique, une souche doit être Gram-positive, catalase et oxydase négative.
La fermentation est connue depuis des siècles comme procédé de préservation et de conservation des aliments. Encore aujourd'hui, une vaste gamme d'aliments et de boissons fermentés est produit à l'aide de différents ferments et technologies. Les propriétés importantes d'un ferment sont l'acidification rapide, la préservation microbienne du lait, la formation de saveurs spécifiques, les capacités texturantes et les bienfaits pour la santé. La production d'acides organiques durant la croissance bactérienne cause une acidification du produit et protège ainsi contre la prolifération des pathogènes.
Un grand nombre d’EPS microbiens, dont certains possèdent une importance industrielle, sont des homopolysaccharides. Quoique la chaîne du polymère se compose d’un seul type de monomère, les propriétés des homopolysaccharides peuvent varier énormément à cause de leurs structures différentes. Le curdlane, la cellulose et le dextrane, par exemple, montrent des comportements très différents concernant leur capacités épaississantes, bien que seul le D-glucose compose leur chaîne. Les homopolysaccharides peuvent être classés en quatre groupes: α-D-glucanes, β-D-glucanes, fructanes et autres comme polygalactanes. Les homopolysaccharides ont des poids moléculaires très élevés. Ainsi, la masse moleculaire du dextrane produit par Ln. mesenteroides NRRL B-512F varie entre 6.2 et 7.1 · 106 Da, et celles des levanes et fructanes, produits par S. mutans vont jusqu'à 21.6 · 106 Da et 12.4 · 106 Da, respectivement (Cerning 1990). La Fig. 1.1 montre comme exemple la structure du dextrane qui est un homopolymère.
Les hétéropolysaccharides microbiens sont composés principalement d’unités répétitives, variables dans leur taille, soit des di- à octasaccharides. En général, ils ont des poids moléculaires élevés de 5 · 105 à 2 · 106 Da et sont formés d'unités répétitives de 1 à 8 monosaccharides. Parmi ces sucres monomères on trouve le glucose, le galactose, le rhamnose, le mannose, le N-acétylglucosamine et l'acide glucuronique. De plus, il y a aussi des résidus qui ne sont pas des sucres, comme le phosphate, l'acétyle et le glycérol. Les différentes structures des hétéropolysaccharides ont été résumées par De Vuyst et Degeest (1999b), Riccardi et Clementi (2000), De Vuyst et al. (2001) et Ruas-Madiedo et al. (2002a). La Fig. 1.2 présente la structure de l'unité répétitive de l'EPS synthétisé par Lb. rhamnosus RW-9595M. Il s'agit d'un heptasaccharide contenant du glucose, galactose et rhamnose dans le rapport 2:1:4 et un groupement pyruvate.
La fermeté, la consistance et la capacité de rétention d'eau sont des caractéristiques importantes dans beaucoup de produits laitiers comme le yoghourt, le fromage et les laits fermentés. Elles sont fortement influencées par le ferment utilisé. Ainsi, durant la production d'un yoghourt avec des souches filantes, la fermeté du produit est réduite par la production d'EPS (Laws et Marshall 2001; Marshall et Rawson 1999). La microscopie confocale montre des espaces vides autour des bactéries productrices d'EPS dans un yoghourt, ce qui affecte l'intégrité de la matrice protéique (Hassan et al. 1995). Ainsi, on constate que des yoghourts faits avec des cultures productrices d'EPS montrent une rétention d'eau accrue et une susceptibilité diminuée envers la synérèse (Wacher-Rodarte et al. 1993).
Même si la contribution des EPS à la viscosité des laits fermentés est une supposition généralement acceptée, il y a très peu d'études caractérisant les EPS sur les aspects rhéologiques. D'ailleurs, il n'y a pas de corrélation claire entre la viscosité des laits fermentés et la concentration en EPS (Wacher-Rodarte et al. 1993). Sebastiani et Zelger (1998) n'ont pas pu trouver un rapport entre la quantité d'EPS produite par différentes souches thermophiles et la viscosité du lait et du milieu M17 fermentés. D'autre part, un ajout de peptone au milieu a augmenté considérablement la production d'EPS par une souche de S. thermophilus, de même que la viscosité du milieu. Bouzar et al. (1997) et Dupont et al. (2000) ont également observé une augmentation de la viscosité du lait fermenté au cours de la culture avec des souches productrices d'EPS et ont suggéré que la production d'EPS en est responsable.
Les propriétés rhéologiques des EPS dépendent de plusieurs facteurs. Tout d'abord, la viscosité intrinsèque est une fonction de la masse moléculaire et du rayon hydrodynamique du polymère (Tuinier et al. 1999a). Ce rayon est une mesure de la grandeur du polymère et dépend de sa masse moléculaire et de la flexibilité de la chaîne polymèrique (Tuinier et al. 1999b). Afin d'obtenir une viscosité élevée, la masse moléculaire doit être haute et la chaîne doit être rigide. La masse moléculaire d'un EPS produit par Lb. sake 0-1 est comparable au xanthane, avec respectivement 6 · 106 Da et entre 4 · 106 et 9 · 106 Da, mais sa viscosité est plus élevée (van den Berg et al. 1995). Dans ce cas, c'est la présence du groupe phosphate avec sa charge négative qui augmente le volume hydrodynamique et la viscosité intrinsèque (Ruas-Madiedo et al. 2002a). De plus, les différentes ramifications de la structure des EPS et les interactions des EPS avec d'autres constituants du lait comme les caséines contribuent aux différents comportements rhéologiques observés.
Récemment, les caractéristiques moléculaires des EPS de plusieurs souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris ont été corrélées avec la viscosité des laits fermentés (Ruas-Madiedo et al. 2002b). Les auteurs ont montré qu'un EPS produit in situ dans des quantités typiques d'environ 100 mg/l n'augmente pas significativement la viscosité du lait si sa viscosité intrinsèque est plus petite que 1.5 m3 kg-1.
Les effets bénéfiques des bactéries lactiques pour la santé du consommateur sont reconnus depuis longtemps. Déjà, le zoologiste et microbiologiste Ukrainien Ilia Ilitch Metchnikov (1845-1916) a mis en rapport la longévité de certains peuples, dont les Bulgares, et la protection de l'organisme contre plusieurs maladies par la consommation de laits fermentés et ainsi l'indigestion de grands quantités de bactéries lactiques. Aujourd'hui, l'incorporation des bactéries dites probiotiques dans l'alimentation humaine a conduit à l'apparition de nouveaux produits laitiers dont certains ont un succès considérable sur le marché. Un probiotique est un supplément alimentaire microbien vivant qui a des effets bénéfiques sur son hôte en améliorant l'équilibre de la flore intestinale, tandis qu'un prébiotique est un ingrédient alimentaire non digestible qui a des effets bénéfiques sur son hôte en stimulant de façon sélective la croissance et/ou l'activité d'une ou plusieurs bactéries présentes dans le côlon (Gibson et Roberfroid 1995). Les synbiotiques correspondent aux produits dans lesquels un probiotique et un prébiotique sont présents (Gibson et Roberfroid 1995).
Il a été proposé que l'effet sur la santé des LAB produisant des EPS est attribuable aux activités biologiques de ce biopolymère. Les EPS pourraient contribuer à la santé humaine comme prébiotique ou grâce à leurs propriétés anti-tumorales, antivirales, anti-cancérigènes et immunomodulatrices (De Vuyst et Degeest 1999b). De plus, une diminution du taux de cholestérol chez des rats ayant consommé du lait fermenté par la souche L. lactis spp. cremoris SBT 0495 a été observée et attribuée à l'EPS produit par cette souche (Nakajima et al. 1992).
L'EPS de Lb. rhamnosus RW-9595M a été testé in vitro pour ses propriétés immunomodulatrices sur des cellules de souris et humaines (Chabot et al. 2001). Les auteurs montrent une stimulation de la production de TNF, IL-6 et IL-12 des cellules humaines et des souris et de IFN-γ de splénocytes des souris. Ces résultats suggèrent la possibilité de stimuler le système immunitaire par l'EPS des LAB, dans les individus sensibles à un tel stimulus (Chabot et al. 2001).
La susceptibilité à la digestion pourrait être une caractéristique importante pour le rôle possible d'un EPS comme prébiotique, car, comme déjà mentionné, une des caractéristiques d'un prébiotique est sa non-digestibilité par l'humain. En soumettant la souche L. lactis ssp. cremoris MG1614 et son variant isogénique NZ4010 et producteur d'EPS à des conditions de digestion in vitro, Looijesteijn et al. (2001) ont trouvé que la présence de l'EPS ne protège pas la souche productrice lors du transit digestif, même si l'EPS n'était pas dégradé. Lors d'une étude de biodégradabilité des EPS par des microorganismes gastrointestinaux humains (Ruijssenaars et al. 2000), les EPS produit par S. thermophilus SFi39 et SFi12 ont été dégradés contrairement à ceux produits par Lb. sake 0-1, S. thermophilus SFi20 et Lb. helveticus Lh59. Afin de prouver le potentiel prébiotique des EPS des LAB, des études supplémentaires sur leur biodégradabilité et leur décomposition par la communauté bactérienne gastro-intestinale doivent être réalisées.
Plusieurs études ont proposé que les EPS ont une activité anti-cancérigène. Kitazawa et al. (1991) ont postulé que l'EPS produit par L. lactis ssp. cremoris KVS 20 est responsable d'un effet anti-tumoral de cette souche. Ceci a été observé lors d'injections intrapéritonéales chez des souris. Dans une étude subséquente, Kitazawa et al. (1996) ont attribué à un exophosphopolysaccharide produit par cette souche une activation des macrophages et l'induction de la production de cytokine. Kitazawa et al. (1998) ont fractionné l'EPS produit par Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus OLL 1073R-1 en un polysaccharide neutre et un polysaccharide acide. La fraction acide composée de glucose, galactose et phosphore a démontré une activité mitogénique sur les lymphocytes B, dirigée par le groupement phosphate. Une activité mitogénique a aussi été observée in vitro pour un polysaccharide d'une taille de 1.5 · 106 Da produit par Bifidobacterium adolescentis M101-4 (Hosono et al. 1997). Un effet anti-cancérigène a été trouvé in vitro et in vivo pour les polysaccharides capsulaires de Bifidobacterium breve YIT4014 et 4043 et Bifidobacterium bifidum YIT 4007 (Nagaoka et al. 1994). Ces polysaccharides étaient composés principalement de rhamnose. Il a été montré que les polysaccharides contenant plus de 60% de rhamnose se sont montrés plus efficaces pour le traitement du cancer gastro-intestinal.
Tous les travaux mentionnés jusqu'ici ont été fait in vitro ou par injection de l'EPS à des rats ou des souris. Très peu d'expériences ont été réalisées in vivo avec administration orale de l'EPS. Zubillaga et al. (2001) ont administré l'EPS KGF-C oralement. Les auteurs ont observé un retardement de la croissance des cellules cancéreuses par cet EPS soluble dans l'eau et extrait de grains de kéfir.
Le site de la synthèse des EPS et la nature des précurseurs permettent de distinguer deux types principaux de biosynthèse par les LAB: la synthèse en dehors de la cellule (produisant des homopolysaccharides) ou celle à la membrane cellulaire (produisant des hétéropolysaccharides). Dans le premier cas, ce sont principalement, Ln. mesenteroides (dextranes), S. mutans (mutanes) et S. salivarius (levanes) qui produisent des homopolysaccharides; alors que les hétéropolysaccharides sont produits par des bactéries lactiques mésophiles (ex. L. lactis, L. cremoris, Lb. casei) et thermophiles (ex. Lb. bulgaricus, S. thermophilus).
Les homopolysaccharides sont synthétisés en dehors de la cellule grâce à des enzymes excrétés par la bactérie. Dans la production du dextrane, par exemple, seulement une enzyme est utilisée, la dextranesucrase. Cet enzyme est spécifique pour le sucrose et l'énergie pour la polymérisation vient de son hydrolyse. Le dextrane peut être produit à partir de cultures cellulaires de Ln. mesenteroides ou de préparations de l'enzyme sans cellules vivantes, éventuellement immobilisée (Cerning 1990).
La synthèse des hétéropolysaccharides, par contre, a lieu à la membrane cytoplasmique. L'EPS est construit par polymérisation des unités répétitives formées dans le cytoplasme (Cerning 1990; De Vuyst et Degeest 1999b). L'unité répétitive est assemblée à la membrane cytoplasmique par addition successive d'unités glucosyle au polysaccharide naissant qui est probablement ancré sur un transporteur lipidique, nommé C55. Après complétion de l'unité répétitive, celle-ci est transportée au travers de la membrane cellulaire et polymérisée à l'extérieur de la cellule pour former l'hétéropolysaccharide, avec un poids moléculaire finale élevé d'environ 1 · 106 Da. La synthèse des hétéropolysaccharides par des LAB implique donc un grand nombre d’enzymes différentes comme, par exemple, l’UDP-glucose déshydrogénase, la glucosyl-transférase et la galactosyl-transférase. Plusieurs de ces enzymes ne sont pas seulement actives dans la synthèse des EPS, mais aussi impliquées dans d’autres activités métaboliques. La Fig. 1.3 montre les voies métaboliques impliquées dans le catabolisme des sucres et dans l'anabolisme des EPS chez certaines bactéries lactiques. On voit l'importance des sucres nucléotidiques, dérivés des sucres-1-phosphates qui, après avoir été transformés par des enzymes d'épimérisation, de décarboxylation, de phosphorylation et de déshydrogénation, sont assemblés pour former l'unité répétitive de l'EPS. Les précurseurs intracellulaires ont été dosés par résonance magnétique nucléaire 31P pour deux souches de Lactococcus lactis, une souche productrice (EPS+) et une non-productrice (EPS-) (Ramos et al. 2001). Les concentrations des précurseurs d'EPS, l'UDP-glucose et l'UDP-galactose, ont été plus faibles dans la souche EPS+ que dans la souche EPS-. Les précurseurs de la biosynthèse du peptidoglycane, l'UDP-N-acétylglucosamine et l'UDP-N-acétylmuramoyl-pentapeptide, ont été les produits derivés des UDP-sucres majeurs détectés chez les deux souches, mais leur concentration a été plus élevée dans la souche EPS+, ce qui confirme la compétition entre la synthèse d'EPS et la croissance cellulaire (Ramos et al. 2001).
Une fois que les sucres nucléotidiques sont formés, les glycosyl-tranférases commencent leur activité pour la formation de la chaîne de sucres (Fig. 1.4). Ces enzymes spécifiques attachent le premier monomère au transporteur lipidique qui se trouve ancré à la paroi cytoplasmique. Dans la synthèse des hétéropolysaccharides, les transporteurs lipidiques semblent jouer un rôle important. Ce sont des esters phosphates et des alcools isoprénoïdes à longues chaînes, identiques à ceux décrits dans la biosynthèse des lipopolysaccharides, de l’antigène O et du peptidoglycane (Sutherland 1990). Le rôle des transporteurs lipidiques dans la synthèse des EPS serait de servir d'ancrage et de faciliter la formation précise et ordonnée de la chaîne glucidique et le transport à travers la membrane cellulaire. Les sous-unités répétitives sont assemblées sur le côté interne de la membrane et ensuite chaque sous-unité est transféré au travers la membrane. Une fois à l'extérieur de la cellule, plusieurs centaines, voir milliers, d'unités répétitives sont liés ensemble par une polymérase. Certains polysaccharides sont polymérisés sur le côté interne de la membrane cytoplasmique suivi de l'exportation du polymère. Certaines protéines, liés à des lipides, pourraient jouer un rôle comme flippase-exportateur et polymérase de l'unité répétitive (De Vuyst et al. 2001). Après l'excrétion, le polymère est soit libéré ou reste attaché à la surface de la cellule formant la capsule. Le mécanisme de la polymérisation, de la détermination de la longueur de chaîne, et de l'exportation n'est pas encore clair.
Fig. 1.3 Schéma des voies métaboliques impliquées dans le catabolisme du lactose/galactose et la biosynthèse des EPS par Lactococcus lactis Gal+ (via les systèmes phosphoénolpyruvate PEP et phospho-transférase PTS) et par Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus Gal- (via l'antiport lactose/galactose) (De Vuyst et al. 2001).
Les numéros se rapportent aux enzymes impliquées: (1) phospho-β-galactosidase, (2) β-galactosidase, (3) glucokinase, (4) phosphoglucomutase, (5) UDP-glucose pyrophosphorylase, (6) UDP-galactose 4 epimérase, (7) dTDP-glucose pyrophosphorylase, (8) deshydratase, (9) epimérase réductase, (10) phosphoglucose isomérase, (11) 6-phosphofructokinase, (12) fructose-1,6-bisphosphatase, (13) fructose-1,6-di-phosphate aldolase, (14) galactose 6-phosphate isomérase, (15) tagatose 6-phosphate kinase, (16) tagatose-1,6-di-phosphate aldolase, (17) galactokinase, (18) galactose-1-phosphate uridylyltransférase, (19) glutamine-fructose-6-phosphate transaminase, (20) glucosamine-phosphate acétyltransférase, (21) acétylglucosaminephosphate mutase, (22) UDP-glucosamine pyrophosphorylase, (23) UDP-N-acétylglucosamine 4-epimérase.
Les alcools isoprénoïdes ne sont pas seulement impliqués dans la production des lipopolysaccharides, mais aussi dans celle des peptidoglycanes et acides téichoïques. Comme la disponibilité de l’alcool isoprénoïde est essentielle pour la production des EPS, la compétition pour cette substance a un effet direct sur la production. Si les bactéries ont une croissance lente, leur besoin en phosphate d’isoprénoïde pour la formation des polymères de la paroi est réduit et la production d’EPS dispose d'une plus grande quantité de ces molécules. Pour cette raison, une meilleure production d’EPS dans des conditions moins propices à la croissance des bactéries a été souvent observée, surtout pour les LAB mésophiles (Cerning 1990; De Vuyst et Degeest 1999b) (voir aussi chapitre 1.2.5.5).
Fig. 1.4 Modèle de la biosynthèse d'EPS par Lactococcus lactis ssp. lactis NIZO B40 (Van Kranenburg et al. 1998)
Après la formation des unités répétitives, celles-ci sont transportées au travers de la membrane, probablement à l'aide d'une flippase, puis polymérisées et excrétées dans le milieu environnant (Van Kranenburg et al. 1997).
Depuis une décennie, il y a eu plusieurs études sur les mécanismes de la biosynthèse des EPS et les voies métaboliques sont maintenant relativement bien connues. Ceci permet de mieux comprendre l'influence des conditions de culture et du milieu de culture sur la nature et la composition des EPS (voir chapitre 1.2.5). De plus, une connaissance approfondie des voies métaboliques permet d'identifier les enzymes clés de la production d'EPS et ainsi, par le génie génétique, de moduler cette production et de créer des souches hyperproductrices d'EPS ayant une structure définie (Ramos et al. 2001).
Le premier travail portant sur les gènes structuraux impliqués dans la production des EPS par les LAB a porté sur les gènes chez S. thermophilus Sfi6 (Stingele et al. 1996). Les auteurs ont trouvé un seul locus chromosomique responsable pour la production d'EPS. Par la suite, Van Kranenburg et al. (1997) ont identifié les gènes responsables de la production d'EPS chez L. lactis NIZO B40 (Van Kranenburg et al. 1997) et ont montré que ces gènes sont de nature plasmidique. Depuis, plusieurs recherches sur la génétique de la biosynthèse d'EPS par les LAB ont été réalisées et les gènes impliqués ont été identifiés (pour une revue récente voir Jolly et Stingele 2001). Dans tous les cas, ces gènes sont organisés dans un locus montrant une bonne conservation en ce qui concerne leur organisation (Boels et al. 2001). La séquence des fonctions de tout ces opérons semble être comme suit: régulation, détermination de la longueur de la chaîne, biosynthèse de l'unité répétitive, polymérisation et exportation (Jolly et Stingele 2001).
Les deux opérons eps des LAB les mieux caractérisés sont probablement ceux de L. lactis NIZO B40 et de S. thermophilus Sfi6. L. lactis NIZO B40 héberge le plasmide pNZ4000 de 42,180 pb qui contient l'opéron eps de 12 kb (voir Fig. 1.5) (van Kranenburg et al. 2000). Par la comparaison des séquences, les fonctions de la plupart des gènes ont pu être trouvées. Les produits des gènes epsDEFGH et epsJ sont supposés agir comme glycosyltransférases avec comme premier enzyme le EpsD qui commence avec la construction de la chaîne glucidique de l'unité répétitive en attachant une molécule glucose de l'UDP-glucose à un transporteur lipidique (Van Kranenburg et al. 1997). Ensuite, les autres glycosyltransférases EpsE, EpsF, EpsG continuent à construire l'épine dorsale de l'unité répétitive. EpsH et EpsJ sont supposés être impliqués dans l'attachement des molécules de ramification, le rhamnose et le galactose-phosphate. EpsI et EpsK sont homologues à des protéines de polymérisation et d'exportation impliquées dans la production des lipopolysaccharides chez les bactéries Gram-négatives.
Chez S. thermophilus Sfi6, un locus chromosomique d'une taille de 14.52 kb regroupe les 13 gènes epsA à epsM dont les produits sont impliqués dans la production de l'EPS (Stingele et al. 1996). La Fig. 1.5 montre l'organisation de ce locus. L'expression des gènes epsE, epsF, epsG et epsI dans Escherichia coli et des réactions des glycosyl transférases in vitro a permis d'identifier les produits EpsE comme étant une β-galactose transférase, EpsG une α-1,3-N-acétylgalactosamine transférase et EpsI une β-1,3-glucose transférase. EpsF serait alors un α-1,6-galactose transférase, car epsF est le seul gène codant pour une glycosyltransférase qui n'a pas été assigné. Les gènes epsC et epsD sont putativement impliqués dans la polymérisation des unités tandis que epsM serait responsable de l'exportation. Finalement, epsJ serait impliqué dans la polymérisation des unités répétitives.
Ces dernières années, plusieurs travaux sur la biosynthèse des EPS par les LAB ont été conduits. Pour certaines souches, les séquences de gènes codant pour la production d'EPS, la structure de l'EPS correspondant et les voies métaboliques des sucres sont connues. Cependant, il y a encore une manque de donnés sur le rapport entre les séquences de gènes et la production d'EPS. Il reste à éclaircir s'il y a des éléments contrôlant l'expression des gènes, où si les gènes sont toujours actifs, et le niveau de contrôle se trouve plutôt avec l'activité des enzymes impliquées. Néanmoins, il a déjà été possible de contrôler la production d'EPS non seulement par les conditions de fermentation mais aussi en appliquant des techniques génétiques. Les premiers résultats utilisant l'expression hétérologue des gènes eps de S. thermophilus Sfi6 dans la souche L. lactis MG1363 EPS- montrent que cette technique peut résulter dans la production d'EPS par la souche réceptrice (Stingele et al. 1996). Toutefois, seulement de faibles quantités d'EPS ont été produites dans l'hôte hétérologue. L'EPS produit avait une masse moléculaire semblable mais une structure différente de celle de la souche originale. Même si une meilleure connaissance des mécanismes impliqués est encore nécessaire, ces résultats sont très prometteurs pour des travaux futurs. La sur-expression des gènes eps peut résulter dans des productivités augmentées et les EPS produits peuvent avoir des structures et des propriétés modifiées et ils pourraient être utilisés comme nouveaux agents épaississants. Cependant, les LAB génétiquement modifiées et leur produits doivent être approuvés légalement et être acceptés par les producteurs et consommateurs.
Les propriétés des EPS des LAB peuvent différer considérablement d'une souche à l'autre. Leur biosynthèse et sécrétion peut avoir lieu durant des phases de croissance différentes. En outre, les conditions de croissance comme la composition du milieu de culture, la température, le pH, la tension d'oxygène et la vitesse d'agitation peuvent influencer la quantité mais aussi la composition et la taille de l'EPS. Cependant, des résultats contradictoires ont été rapportés concernant l'influence de ces paramètres sur la production des EPS.
Au début des recherches sur la production des EPS par les LAB, aucune production n'a été observée dans des milieux semi-définis comme le MRS. Ainsi, plusieurs travaux ont été réalisés dans le lait (Cerning et al. 1986; 1988; Cerning et al. 1990; 1992; De Vuyst et al. 1998; Garcia-Garibay et Marshall 1991) ou dans un milieu à base du lactosérum (Gassem et al. 1997a; Macedo et al. 2002a; Macedo et al. 2002b). Seulement récemment des milieux semi-synthétiques et synthétiques ont été utilisés (Cerning et al. 1994; Dupont et al. 2000; Grobben et al. 2000; Grobben et al. 1995; Grobben et al. 1996; Grobben et al. 1997; Kimmel et Roberts 1998; Petry et al. 2000; Pham et al. 2000; Torino et al. 2000; van den Berg et al. 1995). En effet, un milieu chimiquement défini est plus approprié pour l'étude de la biosynthèse des EPS par les LAB et des voies métaboliques impliquées. Dans ces milieux il n'y a pas de composants qui interférent avec la quantification et avec l'analyse des EPS. Pourtant, les composants des milieux complexes, comme le peptone ou l'extrait de bœuf ou de levure, permettent une bonne croissance des LAB et souvent même une bonne production d'EPS, mais ils contiennent d'autres polymères pouvant interférer avec le dosage et l'analyse des EPS (Kimmel et Roberts 1998; Torino et al. 2000).
La production d'EPS par les souches productrices varie énormément et dépend des conditions de culture des bactéries. Une comparaison des données de la littérature des rendements en EPS par les LAB doit être faite avec réserve car des techniques de quantification et des milieux de culture différents ont été utilisés. Ceci peut avoir une forte influence sur les résultats (voir aussi chapitre 1.2.6.1). Une vue d'ensemble sur les productions d'EPS les plus importantes est donnée dans le Tab. 1.1. En général, des concentrations d'EPS de 50 à 600 mg/l dans des conditions optimales de production ont été obtenues (De Vuyst et Degeest 1999b; Ricciardi et Clementi 2000). Par contre, des productions maximales de 1.14 g/l par S. thermophilus LY03 (Degeest et de Vuyst 1999), de 1.37 g/l par Lb. sakei 0-1 (van den Berg et al. 1995) et de 2.77 g/l par Lb. rhamnosus RW-9595M (Macedo et al. 2002b) ont été rapportées. Un effet synergique entre les souches thermophiles S. thermophilus et Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus a été observé dans deux études différentes (Tab. 1.1). Une souche productrice d'EPS de S. thermophilus (CNRZ 1066) en combinaison avec une souche non-productrice de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (CNRZ 398) a produit une quantité d'EPS (800 mg/l) beaucoup plus élevée que la souche productrice seule (Cerning et al. 1990). De plus, la production de la souche Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus CNRZ 1187 a été plus élevée en culture mixte avec une souche non-productrice de S. thermophilus qu'en culture pure (Bouzar et al. 1996; 1997).
CDM: milieu chimiquement défini. SDM: milieu semi-défini. mCDM: milieu chimiquement défini modifié. PLS: perméat de lactosérum. LS: lactosérum. EL: extrait de levure. BMM comp: vitamines, sels et acides aminés du milieu semi-défini BMM.B: fermentation en batch. FB: fermentation en fed-batch. C: fermentation en continu. pH: avec contrôle de pH
Plusieurs des premières recherches sur la production d'EPS par les LAB ont été conduites avec un milieu à base du lait. Il a été observé que l'addition des caséines hydrolysées au lait a augmenté la croissance et la production d'EPS d'une culture de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (Cerning et al. 1990; Garcia-Garibay et Marshall 1991). Toutefois, dans une étude de Cerning et al. (1986), la caséine a stimulé la production d'EPS par Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus mais pas sa croissance. Néanmoins, une souche de S. thermophilus peut produire la même quantité d'EPS dans le lait ou le lait ultrafiltré (Cerning 1990). La stimulation de la production d'EPS par la caséine hydrolysée reste controversée. D'une part son addition à une culture de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus dans un milieu défini MRS n'augmente pas la production spécifique (Garcia-Garibay et Marshall 1991), mais c'est le contraire qui se produit pour un milieu semi-défini à base de lactosérum (Kimmel et al. 1998).
Pour certaines bactéries Gram-négatif comme des souches de Xanthomonas, Pseudomonas et Rhizobium, une limitation de l'azote résulte en une production accrue d'EPS (Sutherland 1990). Pour les bactéries lactiques, cela ne semble pas être le cas. Il semble plutôt qu'un équilibre optimal entre la source de carbone et d'azote soit nécessaire pour obtenir des productions élevées d'EPS (De Vuyst et Degeest 1999b). La souche L. lactis ssp. cremoris LC 330 produit deux EPS différents (Marshall et al. 1995), un EPS neutre avec une haute masse moléculaire et un phosphopolysaccharide chargé, d'une masse moléculaire plus petite. Les auteurs ont montré qu'une limitation par l'azote stimule la production de l'EPS neutre mais pas celle de l'EPS chargé. Une étude sur l'effet de la concentration de bactocasitone entre 10 et 40 g/l dans un milieu semi-défini pour des fermentations de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus RR a montré qu'une concentration de 30 g/l est optimale pour la production d'EPS (354 mg/l) (Kimmel et al. 1998).
Une étude sur l'effet de différentes sources d'azote sur la croissance de Lb. rhamnosus RW-9595M dans un milieu à base de perméat de lactosérum a identifié un isolat de protéine de lactosérum, un concentré de protéine de lactosérum et un extrait de levure comme étant les meilleures sources d'azote (Macedo 2001). Aucune différence significative entre ces trois milieux a été observée pour la biomasse maximale lors des fermentations, tandis que la production d'EPS a été maximale avec le concentré de protéine de lactosérum. Dans un travail ultérieur sur l'effet d'une supplémentation d'un milieu à base de perméat de lactosérum et de l'extrait de levure avec des groupes de nutriments utilisés dans la formulation du BMM, une influence significative du groupe des acides aminés sur la production d'EPS par Lb. rhamnosus RW-9595M a été observée (Macedo et al. 2002b).
La source de carbone a une influence majeure sur la biosynthèse des EPS par les LAB. En plus du type de sucre (glucose, galactose, lactose, mannose, fructose etc.) et du rapport entre eux, la concentration des sucres peut avoir un effet stimulant sur la production (Cerning et al. 1992; Cerning et al. 1994; Gamar et al. 1997). La production d'EPS par Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus a été plus grande dans un milieu avec du glucose ou du lactose que dans un milieu avec du fructose, tandis que la supplémentation en mannose a résulté en une croissance et une production d'EPS faible (Grobben et al. 1995; Grobben et al. 1996). Gancel et Novel (1994) ont comparé le rendement en EPS de S. salivarius ssp. thermophilus. Le rendement avec le milieu contenant du glucose et du fructose a été plus élevé qu’avec le lactose ou le saccharose, tandis que la prolifération des bactéries a été moins rapide. Cerning et al. (1994) ont étudié la production d’EPS par Lb. casei CG11 en variant la source de carbone (galactose, glucose, lactose, saccharose, maltose, mélibiose). Ils ont trouvé qu’avec le lactose et le galactose, la production d’EPS a été la plus faible, alors que le glucose a été de loin la source la plus efficace. Pour Lb. rhamnosus C83, le mannose ou une combinaison de glucose et de fructose ont favorisé la production d'EPS (Gamar et al. 1997). Une combinaison de glucose et de lactose dans un milieu de culture a augmenté la production d'EPS par S. thermophilus LY03 et S. thermophilus Sfi20, comparé avec un milieu de culture avec le glucose ou le lactose seul, même si la concentration totale des sucres était la même (7.5%) (Degeest et de Vuyst 2000; Degeest et al. 2001b).
Les minéraux et les vitamines ont aussi une forte influence sur la croissance des LAB et leur production d'EPS. Par exemple, la production d'EPS par Lb. casei CRL 7 a doublé après ajout de Mn2+ dans un milieu défini (1995a; Mozzi et al. 1995b). Grobben et al.(1998) ont examiné les besoins nutritionnels de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus NCFB 2772 en utilisant un milieu défini. Ils ont trouvé une augmentation de la production spécifique d'EPS de 130 à 250 mg/l après omission de plusieurs vitamines non-essentielles du milieu défini. Enfin, Macedo et al. (2002b) n'ont pas trouvé un effet significatif du groupe des vitamines, utilisées dans la formulation du BMM, sur la production d'EPS par Lb. rhamnosus RW-9595M dans un milieu à base de perméat de lactosérum et d'extrait de levure. Toutefois, l'adition du groupe des minéraux a eu une influence majeure et a augmenté considérablement la production d'EPS. La production maximale en EPS dans cette étude de 2775 mg/l a été atteint dans un milieu perméat de lactosérum supplémenté avec d'extrait de levure, des minéraux, des sels et des acides aminés.
D'après Sutherland (1972), la composition du milieu n'a pas d'effet sur la composition de l'EPS produit. Cependant, un changement majeur de la composition en monosaccharides des EPS produits par les LAB selon la composition du milieu de culture a depuis souvent été observé. L'addition de glucose et de saccharose au milieu lait ou lait ultrafiltré n'a pas seulement stimulé la production d'EPS par Lb. casei mais aussi changé sa composition, le glucose devenant le monosaccharide dominant (Cerning et al. 1992). Contrairement à l'EPS produit par cette souche sur le milieu BMM (Cerning et al. 1994), le rhamnose ne se retrouvait plus dans la composition de l'EPS. Les auteurs ont conclu que cette souche était capable de produire plus qu’un seul type d’EPS. En outre, ils ont trouvé que la dégradation des EPS par la glycohydrolase a été arrêtée après avoir supplémenté le milieu de fermentation avec du glucose. On peut en conclure que, soit l’activité de l’enzyme a été inhibée en présence de glucose, soit le changement de composition des monomères de l’EPS a rendu l’enzyme, fortement spécialisé, incapable de dégrader le polymère. Grobben et al.(1996) ont montré que la quantité et la composition de l'EPS (galactose : glucose : rhamnose; 6.8 : 1.0 : 0.7) produit par Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus NCFB 2772 dans des cultures en continu ne change pas si la culture croît sur du lactose au lieu de glucose. Cependant, avec du fructose comme source de carbone, la production a été inférieure et le rhamnose a été absent de la composition de l'EPS (galactose : glucose; 2.5 : 1.0). Les auteurs ont aussi conclu que la souche produit plus qu'un polysaccharide. Dans une étude ultérieure (Grobben et al. 1997), deux EPS avec des masses moléculaires différentes ont été caractérisés. La production d'un EPS d'une masse moléculaire élevée, ayant une composition en galactose, glucose et rhamnose dans un rapport de 5.0 : 1.0 : 1.0, a été dépendante de la source de carbone, tandis que l'EPS d'une masse moléculaire plus petite, ayant une composition en galactose, glucose et rhamnose dans un rapport de 11.0 : 1.0 : 0.4, a été produit plus constamment, indépendamment de la source de carbone.
Il semble que les LAB mésophiles ont une production maximale d'EPS dans des conditions de croissance sous-optimales (Cerning et al. 1992; Gamar et al. 1997; Gancel et Novel 1994; Gassem et al. 1997a; Kojic et al. 1992; Looijesteijn et al. 1999; Marshall et al. 1995; Mozzi et al. 1995a; van den Berg et al. 1995), tandis que la production d'EPS des LAB thermophiles semble être associée à la croissance (De Vuyst et al. 1998; Garcia-Garibay et Marshall 1991; Grobben et al. 1995; Mozzi et al. 1995a). Si la production d'EPS est associée à la croissance, la biosynthèse de l'EPS commence directement avec la croissance bactérienne et montre la cinétique d'un métabolite primaire. Par exemple, une culture de Lb. rhamnosus C83 dans un milieu défini sans contrôle de pH a montré une production simultanée d'EPS, de lactate et de la biomasse (Gamar et al. 1997). Les auteurs ont conclu à une production d'EPS associée à la croissance. Par contre, une culture de Lb. rhamnosus R dans le milieu BMM et avec contrôle de pH a commencé à produire l'EPS seulement à la fin de la phase exponentielle de croissance (Pham et al. 2000). De plus, la production d'EPS a continué pendant la phase stationnaire de croissance dans le cas des cultures dans le glucose, tandis que la production d'EPS a cessé dans le cas d'une culture dans un milieu additionné de lactose. Les auteurs ont supposé que l'EPS produit par cette souche peut être considéré plutôt comme un produit mineur détourné de la glycolyse que comme un métabolite secondaire. De plus, la souche L. lactis ssp. cremoris NIZO B40 a produit la majorité de l'EPS pendant la phase exponentielle de croissance, lorsque la souche croissait dans un milieu avec le glucose comme source de carbone, tandis qu'avec le fructose, la souche produisait environ 60% de l'EPS dans la phase stationnaire de croissance. Dans une étude sur la production d'EPS par Lb. rhamnosus RW-9595M dans un milieu à base de perméat de lactosérum additionné de yeast nitrogen base (YNB) comme source d'azote, la température de la culture a été variée entre 22 et 42°C (Macedo et al. 2002a). Les auteurs ont montré que la production d'EPS n'était pas liée à la croissance cellulaire pour des températures élevées, alors que c'était le contraire à des températures sub-optimales.
Pour les LAB mésophiles, des conditions de culture comme la température, le pH ou la composition du milieu peuvent permettre de découpler la croissance cellulaire de la production d'EPS (Looijesteijn et Hugenholtz 1999). La production d'EPS peut être augmentée en appliquant les conditions environnementales stimulant la biosynthèse d'EPS une fois qu'assez de biomasse est formée (Degeest et al. 2001a). L'immobilisation cellulaire pourrait être un moyen efficace de découpler la croissance cellulaire de la production d'EPS et de garder une biomasse élevée dans un système de fermentation, tout en appliquant des conditions de fermentation propices à la production d'EPS (voir chapitre 1.3).
Lors des fermentations, les conditions optimales de température, pH, tension d'oxygène, vitesse d'agitation et temps d'incubation résultent en un rendement en EPS amélioré (De Vuyst et Degeest 1999b; Degeest et al. 2001a; Ricciardi et Clementi 2000). Cependant, plusieurs études montrent que des températures sub-optimales influencent positivement la production d'EPS par les LAB mésophiles et thermophiles (Cerning 1990; Cerning et al. 1992; Gamar et al. 1997; Gancel et Novel 1994; Gassem et al. 1997a; Kojic et al. 1992; Kontusaari and Forsen 1988; Looijesteijn et Hugenholtz 1999; Marshall et al. 1995; Mozzi et al. 1996b; van den Berg et al. 1995). Encore une fois, ces observations ont été expliquées par la disponibilité plus élevée du transporteur lipidique chez des bactéries en croissance lente (voir chapitre 1.2.3). Par exemple, un changement de la température de 37 à 25°C au début de la phase exponentielle de croissance a amélioré significativement la production d'EPS chez Lb. rhamnosus C83 (Gamar-Nourani et al. 1998). Garcia-Garibay et Marshall (1991) ont trouvé une production spécifique d’EPS deux fois plus élevée pour une température (48°C) supérieure à la température optimale de la croissance de la souche Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (37 à 42°C). Cependant, une incubation à des températures sub-optimales n'a pas changé le rendement de la production des EPS avec des bactéries lactiques thermophiles (Sebastiani et Zelger 1998). Dupont et al. (2000) et Macedo et al. (2002a) ont varié la température des cultures de Lb. rhamnosus RW-9595M (32 et 37°C et dans l'intervalle 22-42°C, respectivement) dans des milieux différents. Les deux études n'ont pas trouvé un effet significatif de la température sur la production d'EPS.
Il a été montré qu'un contrôle du pH de la culture augmente la production d'EPS comparé à des conditions acidifiantes (De Vuyst et al. 1998; Gassem et al. 1997a; Grobben et al. 1998; Grobben et al. 1995; Mozzi et al. 1996b). Souvent, le pH optimal pour la production d'EPS est proche de celui pour la croissance (Gamar-Nourani et al. 1998; Grobben et al. 1998; Mozzi et al. 1994; Mozzi et al. 1996b; Petry et al. 2000). Un ajustement périodique du pH à une valeur de 6.2 lors des fermentation en batch avec Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus a augmenté la production des EPS, mesurée par la viscosité du milieu (Gassem et al. 1997a). Lors d'une fermentation en continu (Gassem et al. 1997b), ce résultat a été confirmé avec un pH de 6.5 favorisant la production d’EPS (comparé à un pH de 5.2 et de 5.8). Mozzi et al. (1996b) ont trouvé une production d’EPS considérablement plus élevée pour Lb. casei CRL 87 avec un pH contrôlé, comparée à une culture sans contrôle du pH. Le pH optimal pour la production d'EPS (488 mg/l) a été de 6.0 tandis que le pH optimal pour la production spécifique (3.9 · 10-5 g EPS/g poids sec des cellules) a été de 4.0. De plus, pour des cultures de Lb. sake 0-1, il a été observé qu'un pH plus bas (5.8) favorise la production d'EPS, tandis qu'un pH plus élevé stimule plutôt la croissance de la souche (van den Berg et al. 1995).
L'aération du milieu pendant la culture n'est pas nécessaire pour la production d'EPS par les LAB. Au contraire, il semble qu'une basse tension en oxygène stimule la production (De Vuyst et al. 1998; Looijesteijn et Hugenholtz 1999). Gamar-Nourani et al. (1998) ont identifié une concentration d'O2 de 10% comme étant optimale pour la production d'EPS par Lb. rhamnosus C83. Pham et al. (2000) ont étudié l'effet de l'oxygène sur la production d'EPS par Lb. rhamnosus R. Des concentrations en oxygène basses (jusqu'à 20%) ont augmenté la croissance et la production d'EPS. Cependant, la production spécifique a été plus élevée pour des conditions anaérobe et aérobe. Les auteurs ont conclu que des conditions de stress ont induit la production d'EPS.
Somme toute, il est à conclure que les effets des conditions de culture sur la production d'EPS sont spécifiques pour chaque cas étudié. Les conditions de culture optimales sont à déterminer pour chaque souche.
Traditionnellement, la mesure de la viscosité du milieu fermenté a été utilisée pour estimer la production d'EPS d'une souche dans un milieu liquide (Cerning et al. 1986; Cerning et al. 1988). Cependant, cette valeur n'est pas nécessairement corrélée avec la quantité d'EPS produite (Sebastiani et Zelger 1998) (voir aussi chapitre 1.2.2.1) et est fonction des interactions des EPS avec d'autres constituants du milieu. Ces interactions sont de nouveau fonction de plusieurs facteurs comme le pH, la température et la force ionique du milieu.
Pour estimer la quantité d'EPS dans un milieu fermenté, il faudrait alors utiliser une méthode de dosage spécifique. Cependant, une telle méthode n'existe pas. Différents composants du milieu interfèrent avec la plupart des méthodes de dosage. Dans la plupart des cas, une étape de purification avant le dosage est alors indispensable. L'isolement et la purification de l'EPS produit dans un milieu complexe tel que le lait ou le lactosérum est difficile à cause de la viscosité élevée du milieu fermenté, des faibles quantités d'EPS et de la contamination par les protéines du lait. La première étape de purification est souvent une centrifugation, afin de séparer les cellules du milieu. Cependant, la viscosité élevée empêche souvent une sédimentation des cellules et rend la séparation plus difficile (Cerning 1990). L'addition d'un solvant organique au surnageant résulte en une précipitation de toutes les macromolécules, incluant les EPS de la solution. La précipitation avec l’éthanol s’est établie comme la méthode standard d’extraction des EPS. Il est aussi possible d’utiliser d’autres solvants polaires de faible poids moléculaire tels que le méthanol, l'acétone et le propane-2-ol, mais leur utilisation n’est pas compatible avec l’usage dans l’industrie agro-alimentaire. L'ajout de sels peut aider à la précipitation d'un EPS chargé (De Vuyst et Degeest 1999b). Cette étape permet d'augmenter la concentration en EPS et de diluer les molécules de petite taille, notamment les mono- et disaccharides interférant avec le dosage d'EPS. Une élimination complète de ces molécules est souvent obtenue par une dialyse (Cerning 1994; Cerning et al. 1992; De Vuyst et Degeest 1999b; Grobben et al. 1995; Marshall et al. 1995). Surtout si un milieu de culture complexe comme le lait est utilisé, l'EPS partiellement purifié est souvent encore contaminé par la partie protéique du milieu et une précipitation avec l'acide trichloroacétique (TCA) est nécessaire (Macura et Townsley 1984). Comme alternative, une hydrolyse des protéines avec des enzymes protéolytiques est une bonne option pour éliminer les protéines contaminantes (Bouzar et al. 1996; Bouzar et al. 1997; Yang et al. 1999). Gancel et Novel (1994) ont, par exemple, ajouté la pronase pour hydrolyser les polypeptides. Un traitement avec des enzymes tels que la désoxyribonucléase, la trypsine, la pronase et la protéinase K a aussi été recommandé par Cerning (1990). Une fois l'EPS purifié, il est souvent concentré par lyophilisation.
En raison de la longue durée et d'une faible exactitude des méthodes de purification habituelles, plusieurs méthodes alternatives ont été proposées. Par exemple, Nakajima et al. (1990) ont utilisé l'ultrafiltration pour la séparation et la récupération d'un phosphopolysaccharide d'une souche de L. lactis ssp. cremoris. Toba et al. (1992) ont présenté une méthode de purification partielle et de dosage d'un EPS par une méthode d'ultrafiltration à petite échelle.
Le dosage des EPS (partiellement) purifiés peut se faire par simple gravimétrie (De Vuyst et al. 1998) ou par des méthodes colorimétriques. Un dosage gravimétrique nécessite cependant une purification complète de la poudre d'EPS, tandis que les méthodes colorimétriques sont plus spécifiques. Le dosage des sucres totaux par la méthode phénol-acide sulfurique (Dubois et al. 1956) est très fréquemment utilisée. Cette méthode a l'avantage d'être très sensible et de détecter de façon fiable des sucres dans une solution avec des concentrations aussi faibles que 10 mg/l, mais elle n'est pas spécifique pour les EPS et détecte tous les saccharides ainsi que leurs dérivés méthyle-éthers, d'où l'importance d'une bonne purification de l'EPS. Un autre désavantage de la méthode résulte d'une différence de la réponse colorimétrique en fonction du sucre analysé. Cependant, la composition exacte de l'EPS en monomères saccharidiques n'est pas toujours connue. C'est pourquoi le glucose est souvent utilisé pour faire la courbe étalon. L'erreur résultant de la réponse différente des monomères comme le rhamnose est acceptée et les résultats sont exprimés en équivalent glucose.
En résumé, plusieurs méthodes différentes de dosage des EPS sont utilisées dans la littérature, avec des résultats quelquefois questionnables (De Vuyst et Degeest 1999b). Les diverses équipes de recherche utilisent souvent des protocoles adaptés à la souche étudiée et au milieu de culture utilisé, avec des rendements en EPS différents. L'incohérence dans les résultats de quantification d'EPS rend une comparaison de la production par diverses souches très difficile. De plus, les méthodes nécessitent souvent une étape de purification partielle de l'EPS laborieuse et de longue durée (10 jours) qui requiert un volume important de milieu fermenté (100 ml). Un tel volume d'échantillonnage limite fortement la fréquence des prises d'échantillons et le nombre de répétitions de la mesure par échantillon. Il est alors primordial de développer une méthode rapide, exacte et reproductible de dosage d'EPS qui nécessite seulement un petit volume d'échantillon. Dans ce but, nous avons testé dans le Chapitre 2 une nouvelle méthode de purification partielle d'EPS avec des cellules d'ultrafiltration agitées.
Récemment, dans notre équipe de travail, une méthode de quantification de l'EPS produit par Lb. rhamnosus RW-9595M dans le milieu SWP par spectroscopie en proche infrarouge (NIRS) a été mise au point (Macedo et al. 2002c). Cette méthode a permis de doser simultanément l'EPS, l'acide lactique et le lactose directement dans le milieu de fermentation, sans aucun traitement préalable du milieu. Le spectre obtenu par NIRS a été calibré avec des mesures de la concentration d'EPS, prises avec la nouvelle méthode d'ultrafiltration, mentionnée auparavant et développée dans le Chapitre 2, et un coefficient de corrélation de 91% a été calculé. Cette étude a montré que la méthode NIRS peut être utilisée pour prédire simultanément, en moins de 5 min, les concentrations de plusieurs substances, entre autre d'EPS, pendant une fermentation avec des bactéries lactiques. Cependant, la mesure a été affecté par des nombreuses paramètres du milieu ce qui a limité l'exactitude de la calibration de la méthode.
Afin d'élucider la composition et la structure de la molécule d'EPS, un très haut degré de pureté est requis et plusieurs techniques de purification ont été développées à cet effet ces dernières années.Tuinier et al.(1999b) ont mis au point un protocole de purification de l'EPS de L. lactis ssp. cremoris NIZO B40 impliquant plusieurs étapes de filtration avec des membranes ayant différents seuils de coupure et ont examiné les propriétés physiques de l'EPS purifié.
Pour analyser chimiquement les monomères, on est obligé d’hydrolyser le polysaccharide en utilisant un acide concentré et des températures élevées. Parce que les monosaccharides n’ont pas tous la même résistance aux conditions d’hydrolyse, il faut contrôler les conditions avec précision jusqu’à la conversion totale de l'EPS. On peut ensuite déterminer la composition des EPS en utilisant différentes méthodes. L’identification des monomères peut être réalisée par des méthodes enzymatiques, spectrophotométriques, par la chromatographie liquide haute performance (HPLC), la chromatographie en phase gazeuse (GLC) ou avec la spectrométrie de masse.
En raison du grand nombre de liaisons et de configurations possibles dans la formation des EPS, il peut y avoir un grand nombre de structures et de propriétés résultantes. Chaque hexose peut être lié en α ou β, dans la forme pyranose ou furanose et lié à la 2ième, 3ième, 4ième ou 6ième position. Le poids moléculaire peut être déterminé par des méthodes chromatographiques. La méthode HPLC couplée avec la technique de perméation de gel est couramment utilisée (Tuinier et al. 1999b; Van Calsteren et al. 2002), mais aussi les techniques d'électrophorèse, et de chromatographie en phase gazeuse (GLC) (Knoshaug et al. 2000; Lemoine et al. 1997; Looijesteijn et Hugenholtz 1999; Low et al. 1998; Van Calsteren et al. 2002; Van Casteren et al. 1998). Pour l'identification des monomères de l'EPS, la méthode classique est la méthylation suivie de l’hydrolyse, de l’identification et de la quantification, par GLC, des sucres partiellement méthylés (Sutherland 1990). Cette procédure donne des informations sur la taille et la structure des monomères.
Récemment, la technique de la résonance magnétique nucléaire (RMN) a permis de faire des progrès considérables dans l'élucidation de la structure des EPS. En combinaison avec l'analyse chimique, il est possible d'identifier par les spectres 1H-, 13C-et 31P-RMN les substances présentes et leurs liaisons chimiques et ainsi la structure primaire de l'EPS. Avec une biomasse assez importante dans le RMN, il est même possible d'obtenir sans détruire l'échantillon des informations in vivo sur la formation des EPS. De cette façon, Hugenholz et al. (2000) ont pu suivre l'évolution des intermédiaires clés de la formation d'EPS par une souche EPS+ de Lactococcus lactis et les comparer avec une souche isogénique non-productrice.
Van Calsteren et al.(2002) ont isolé et purifié les EPS de Lb. rhamnosus RW-9595M et de Lb. rhamnosus R et les ont analysés par 1H- et 13C-RMN. Les spectres obtenus, et conséquemment les EPS des deux souches, ont été identiques. Par la suite, les auteurs ont déterminé la masse moléculaire de l'EPS par chromatographie de perméation sur gel et ont élucidé la structure primaire de l'EPS par des méthodes chimiques et spectroscopiques afin de confirmer les résultats obtenus par la RMN. Sur la base de ces analyses, l'unité répétitive de l'EPS a été déterminée comme étant un heptasaccharide avec un pyruvate, deux D-glucose, un D-galactose, et quatre L-rhamnose (Fig. 1.2).
La production d'EPS par les LAB étant limitée, il y a très peu d'études portant sur la production à plus grande échelle. Ces EPS n'étant pas (encore) rentables comme ingrédient pour l'industrie agro-alimentaire, la plupart des études se sont concentrées sur la production d'EPS in situ dans les aliments fermentés. Kimmel et al.(1998) ont optimisé la production d'EPS de Lb. delbrueckii ssp. bugaricus RR et ont réalisé une culture à pH contrôlé avec un volume de 100 l dans un milieu semi-défini. Les auteurs ont concentré les EPS du milieu fermenté avec une ultrafiltration et éliminé les matériaux ayant un faible poids moléculaire par une dialyse avant la précipitation avec l’éthanol. Malgré cela, la poudre d'EPS contenait 1.4% de protéines et, en plus, les auteurs ont supposé une perte importante d'EPS lors de la précipitation avec l'éthanol. Une récupération de seulement 30 g d'EPS purifié a été mesurée suite au traitement des 100 l fermentés. Afin de diminuer la perte du produit pendant le procédé, les auteurs recommandent la récupération du polymère par des techniques de filtration. Un tel processus de traitement en aval du milieu fermenté pour la récupération des EPS produits par les LAB pourrait s'inspirer des techniques utilisées dans la fabrication du xanthane. L'ultrafiltration est utilisée pour la concentration du xanthane dans le milieu fermenté (de 2.5 à 15% p/v), avant l'étape de précipitation par l'éthanol. Ceci permet de réduire le volume d'alcool et ainsi la quantité d'énergie utilisée pour la récupération de l'éthanol d'environ 80% (Lo et al. 1997). Des techniques de filtration ont aussi été utilisées avec succès pour la récupération d'EPS produit par Sinorhizobium meliloti M5N1 CS (Harscoat et al. 1999).
En examinant les procédés de production des yoghourts, on remarque que la production a beaucoup changé ses dernières dizaines d'années. Sa rentabilité a augmenté avec la mise en marché des procédés semi-continu. C’est ainsi que la production traditionnelle avec une fermentation dans le pot n’occupe plus une part importante du marché actuel (Cerning 1990). Les nouveaux produits comme les yoghourts avec des fruits, les yoghourts aromatisés ou les yoghourts buvables sont presque tous produits à grande échelle, donc agités et transportés avant leur soutirage. Puisque le yoghourt perd en partie sa texture pendant ces traitements mécaniques, on est obligé d’en augmenter la viscosité. La plupart des producteurs utilisent à cette fin des méthodes comme l'augmentation des solides totaux du lait standardisé, le traitement à la chaleur avant inoculation ou l'addition de stabilisateurs. Ceci implique une augmentation des coûts considérable ce qui rend la production des hétéropolysaccharides in situ par les LAB très intéressante (Bouzar et al. 1997; Marshall et Rawson 1999; Rawson et Marshall 1997).
L’utilisation d’EPS dans l’industrie laitière est basée principalement sur les aptitudes épaississante, gélifiante, stabilisante et émulsifiante de ces composés. Ils jouent donc un rôle important dans la formation de la texture des aliments. Les bactéries lactiques mésophiles et thermophiles sont employées pour améliorer le comportement rhéologique des laits fermentés et des yoghourts. Ces souches offrent la possibilité d’augmenter la viscosité du yoghourt et de diminuer la susceptibilité à la synérèse ce qui est particulièrement intéressant pour les pays interdisant l’addition des gélifiants ou épaississants aux laits fermentés. En outre, ceci permet de diminuer la teneur en solides totaux du lait standardisé pour la fabrication de yoghourt, tout en conservant des propriétés rhéologiques et organoleptiques comparables aux yoghourts témoins produits avec des cultures non épaississantes et enrichis en solides du lait. De plus, en employant les EPS des LAB comme bioingrédients fonctionnels dans les produits laitiers pour remplacer des agents polysaccharidiques d’autres origines (carraghénanes, alginates, xanthanes), on peut produire des produits plus naturels et ainsi répondre à une demande des consommateurs pour des produits sans additifs.
En employant des bactéries lactiques épaississantes productrices d’EPS, il est possible de produire des fromages allégés. Par exemple, l'utilisation d'une souche de S. thermophilus productrice d'EPS et de Lb. bulgaricus a permis de produire un fromage mozzarella allégé avec des propriétés améliorées de fusion et de rétention de l’humidité (Low et al. 1998; Perry et al. 1998; Perry et al. 1997). Une autre application possible des LAB productrices d'EPS est leur utilisation dans le levain. Les EPS aident à ramollir le gluten et ainsi à améliorer la texture du levain et à augmenter le volume spécifique du produit boulanger (De Vuyst et al. 2001).
Appartenant à la classe des fibres alimentaires, les EPS peuvent servir de substituts à basse teneur en calories pour remplacer le gras. C’est ainsi qu’on peut produire des aliments avec moins de gras et de solides totaux, mais avec des propriétés organoleptiques comparables aux produits traditionnels. De cette façon, les EPS pourraient contribuer à offrir une source d’aliments plus sains aux consommateurs.
La technologie des cellules immobilisées (ICT) n’est pas récente. C'est un procédé traditionnel utilisé, par exemple, dans la production du vinaigre par des bactéries acétiques immobilisées sur des copeaux de bois (Ramakrishna et Prakasham 1999) ou dans la production du Kéfir avec des levures coimmobilisées avec des bactéries lactiques (Champagne et al. 1994). L'immobilisation permet de retenir les cellules microbiennes dans un système de fermentation et d'obtenir des hautes densités de biomasse. Cette technique comporte de nombreux avantages, mais aussi des inconvénients, comparé à des procédés utilisant des cellules libres (Tab. 1.2). Les avantages majeurs sont, sans doute, une productivité augmentée de la fermentation et une rétention des cellules, même à de hauts taux de dilution (Champagne et al. 1994). D'autres avantages sont une réutilisation possible des cellules, une protection contre des forces de cisaillement et une stabilité biologique élevée, lors de fermentations en continu (Lamboley et al. 1999). De plus, il est possible que les systèmes avec des cellules immobilisées soient moins susceptibles aux attaques des bactériophages (Champagne et al. 1994) et à la contamination microbienne (Navrátil et Sturdíc 1999).
La haute densité cellulaire et un micro-environnement différent des conditions dans le milieu de culture résultent souvent en un changement morphologique et physiologique de la culture (voir chapitre 1.3.4). Ceci peut représenter un avantage, par exemple en augmentant la tolérance de la souche envers des substances inhibitrices ou en découplant la croissance bactérienne de la production de métabolites (Norton et al. 1994a), ou un désavantage car le métabolisme pourrait être modifié de façon non voulue.
En raison des avantages importants de l'ICT, comparé avec des cultures utilisant des cellules planctoniques, plusieurs techniques d'immobilisation ont été développées. Toutes ces techniques imitent ce qui se passe dans la nature, où les cellules des microorganismes croissent presque toujours dans un biofilm, associées entre elles et avec des surfaces (Dunne 2002). Afin d'immobiliser des cellules, on peut les attacher à des surfaces, les inclure dans des matrices poreuses, les retenir derrière des barrières ou les faire floculer (Fig. 1.6). Nous avons concentré notre travail sur les systèmes dans lesquels les cellules sont immobilisées par adhésion ou inclusion. Les systèmes où les cellules sont immobilisées derrière une barrière (ex. réacteurs avec membrane) et ceux où la barrière est formée autour des cellules (ex. microcapsules) présentent souvent des problèmes de transfert de matière et d'encrassement des membranes (Gonçalves et al. 1992) et ne semblent pas être adéquats pour l'immobilisation des cellules productrices d’EPS.
Fig. 1.6 Classification des systèmes d’immobilisation selon quatre classes (adapté de Willaert et Baron 1996).
L’immobilisation des cellules peut être réalisée par adhésion à la surface de différents supports. Dans cette étude, ce procédé a été choisi en raison du caractère mucoïde de la souche de travail, Lb. rhamnosus RW-9595M. La production par les cellules de polysaccharides capsulaires et d'EPS libre contribue à l'adsorption au support et à sa colonisation subséquente (Dunne 2002). Les forces participant à l'adhésion d'une cellule au support sont la force de Van der Waals, les liaisons ioniques, les ponts hydrogènes et les interactions covalentes. Pour comprendre les mécanismes de l’adsorption microbienne, la structure de la paroi cellulaire doit être connue. La distribution des groupes carboxyliques et aminés dans les composantes de la paroi déterminent la charge de la cellule. En général, la plupart des microorganismes sont chargés négativement. Également, un grand nombre d'EPS et ainsi de capsules portent une charge légèrement négative. Pour cette raison, il est préférable d’utiliser des supports chargés positivement.
Un autre moyen d’immobilisation est l’inclusion des cellules dans une matrice poreuse qui peut être soit un gel, soit un support préformé. Dans le premier cas, la matrice poreuse est formée in situ autour de la cellule. Avec cette technique, les cellules sont incluses dans un polymère. Ensemble, ils forment le biocatalyseur avec lequel la fermentation est exécutée. Ce biocatalyseur est souvent obtenu par dispersion d'une solution de polysaccharides et/ou de protéines contenant les cellules et ensuite par solidification de cette solution. La dispersion peut être réalisée par extrusion ou par émulsification. Une bonne vue d’ensemble de ces procédés est donnée par Groboillot et al.(1994), Champagne et al. (1994) et de Prenosil et al. (1995).
Dans le cas d’un support poreux préformé, on ajoute la matrice d'immobilisation au début d’une fermentation. On laisse diffuser les cellules dans les espaces libres du support où elles commencent à proliférer. Puisque la croissance des colonies est rapidement limitée par le support et les colonies voisines, elles sont alors retenues dans le biocatalyseur (Karel et al. 1985). Afin d'obtenir des biomasses immobilisées élevées, les surfaces intérieures ainsi qu'extérieures doivent être accessibles pour les cellules et les supports avec une porosité élevée sont les plus appropriés. Au début, les forces d'adhésion décrites précédemment, déterminent la vitesse de la colonisation du support. Quand les premières cellules sont adhérées et les colonies se sont formées, le diamètre des pores du support devient important. Il existe une grandeur idéale de pores qui est déterminée par un équilibre entre deux effets: les pores doivent être assez grands pour permettre la pénétration et la croissance des cellules à l’intérieur de la matrice, mais ils doivent être assez petits pour empêcher la perte des cellules en croissance (Prenosil et al. 1995). Messing et al. (1979a; 1979b) ont déterminés la grandeur optimale des pores pour plusieurs microorganismes. Ils ont trouvé un rapport optimal pour les bactéries de 4 à 5 entre la taille du pore et celle de la cellule. L'utilisation des supports avec des pores plus grands que 100 µm représente une forme d'immobilisation se situant entre la floculation et l'inclusion (Karel et al. 1985).
La matrice préformée protège les cellules contre les forces de cisaillement à l’extérieur du biocatalyseur tout en permettant une bonne diffusion des nutriments et des produits métaboliques (De Backer 1996). Ce procédé d'immobilisation n’est pas nuisible pour la prolifération des cellules, comme ça peut être le cas pour certaines techniques d’inclusion dans des billes de polymères formées in situ. Cependant, les densités de cellules sont en général moins élevées qu’avec l’inclusion in situ (Klein et Vorlop 1985). En raison de la forte résistance du support à la compression, cette méthode d’immobilisation est adéquate pour l’utilisation dans des réacteurs comme le réacteur agité ou le réacteur de type lit fixe. Les supports solides sont en général physiquement et chimiquement résistants envers l'usure par la croissance des microorganismes, ils sont souvent stérilisable par la vapeur et réutilisable. La simplicité du procédé et le faible coût rendent l'immobilisation par adsorption sur des supports solides poreux très intéressante pour l’application industrielle. Dans ce travail, la souche Lb. rhamnosus RW-9595M a été immobilisée par adsorption sur des supports poreux solides, car son caractère mucoïde favorise fortement son adhésion aux surfaces.
Pour l'utilisation de l'ICT dans l'industrie agroalimentaire, il existe des exigences concernant la nature du support. Premièrement, il ne doit pas être toxique, ni pour l’homme ni pour les bactéries, et son utilisation dans le domaine alimentaire doit être permis. En outre, il doit montrer des propriétés physiques et chimiques favorisant l’immobilisation. Un support préformé est caractérisé par sa densité, sa taille et sa forme, sa résistance à la friction, sa capacité de rétention des cellules (diamètre des pores et porosité) et sa charge de surface. De plus, il doit être stérilisable.
Le Tab. 1.3 donne une vue d'ensemble sur les matériaux de supports poreux solides rapportés en littérature. Par exemple, Senthuran et al. (1997) ont choisi des billes de verre (foam-glass-particles, Pora-bact A®) pour immobiliser Lb. casei. Ils ont comparé ce matériel avec les mêmes billes prétraitées avec du polyéthylèneimine et ont constaté, d’une part, un rallongement de la phase de latence et, d’autre part, une rétention des cellules améliorée. Gonçalves et al. (1992) ont comparé des supports inertes en verre et en céramique en utilisant un réacteur en régime turbulent en continu avec recyclage. Les supports se sont distingués quant à la densité, au diamètre des particules, et des pores et à la porosité. Les auteurs ont observé un meilleur attachement en conduisant des fermentations en continu, comparé avec un procédé en batch et ont identifié un support en verre aggloméré (Sikug) et un support en céramique (Bi86) comme étant les supports avec la capacité de rétention de biomasse la plus élevée.
Il y a peu de travaux dans la littérature sur la production d'EPS avec des cellules immobilisées, la plupart portant sur la production des homopolysaccharides (impliquant des enzymes extracellulaires). Par exemple, le pullulane a été produit par la moissisure Aureobasidium pullulans immobilisée par inclusion dans des cubes d'agar ou de calcium alginate (West et Strohfus 1998; West and Strohfus 2001), dans des billes de gel d'agarose et de carraghénane (West 2000)et dans des cubes d'éponge (West et Strohfus 1996). Lors de deux fermentations en batch successives, les auteurs ont trouvé des productions d'EPS plus élevées pour les cultures immobilisées qu'avec des cellules libres. El-Sayed et al. (1990) ont comparé la production de dextrane et de dextranesucrase par Ln. mesenteroides immobilisée dans trois types de supports Celite de différents diamètres et tailles de pores et dans des billes de gel d'alginate de calcium. Les auteurs ont trouvé la production de dextranesucrase la plus élevée avec le support Celite R648, qui était 64% supérieure à celle des cultures avec des cellules libres. Robinson et Wang (1987) ont aussi utilisé le support Celite pour immobiliser la bactérie Xanthomonas campestris pour la production de xanthane dans un réacteur de 16 l. Les auteurs ont observé une forte rétention du biopolymère dans la matrice d'immobilisation qui a atteint une concentration de 50 g/l.
Le support solide poreux ImmobaSil® utilisé dans cette thèse pour l'immobilisation de Lb. rhamnosus RW-9595M est fait en caoutchouc de silicone. Il est disponible dans une forme d'anneau appelé Raschig Ring et offre une taille de pores uniforme de 50 à 150 µm et une fraction vide d'environ 40%.
Afin d'élucider les effets de l'immobilisation sur les cellules, des techniques d'analyse du système à cellules immobilisées, idéalement non-destructives, sont nécessaires. Il y a maintenant plusieurs techniques biophysiques disponibles et l'instrumentation pour diverses techniques spectroscopiques s'améliore constamment. Les mesures d'intérêt dans l'examen des systèmes avec cellules immobilisées sont, par exemple, la concentration des cellules immobilisées et les cinétiques de croissance, de consommation de substrat et de formation de produits. Une caractérisation morphologique et physiologique des cellules immobilisées, de même que de leur environnement direct, est aussi d'un grand intérêt. Les méthodes comme la microscopie optique et électronique, le marquage avec des radioisotopes et l'autoradiographie, la microfluorimétrie, la spectroscopie infrarouge et la résonance magnétique nucléaire (RMN) peuvent être utilisées pour étudier des cellules immobilisées (Clark 1989).
La RMN est un outil très puissant pour suivre les processus métaboliques des cellules immobilisées. Cette méthode est non-destructive et a été utilisée, par exemple, pour comparer le métabolisme de levures (Lohmeier-Vogel et al. 1995; 1996; Taipa et al. 1989) et de propionibactéries (Santos et al. 1989) libres et immobilisées. La 31P-RMN permet de mesurer le pH intracellulaire, les sucres phosphatés, l'ADP et l'ATP tandis que la 13C-RMN peut donner des informations sur le métabolisme des sucres (Lohmeier-Vogel et al. 1989). Avec la RMN il est aussi possible de mesurer la quantité des cellules immobilisées (Clark 1989), mais l'application de cette méthode est très limitée à cause de son coût élevé, des interférences avec le support et le milieu, un équipement sophistiqué et dispendieux et une mise au point de méthode très longue.
La quantité de biomasse est un paramètre très important pour l'analyse et le contrôle d'un système de fermentation. Cependant, la quantification précise de la biomasse immobilisée peut être très difficile, surtout si elle est immobilisée sur des supports solides et poreux (Wang 1988). Si les cellules sont incluses dans des billes de gel, la matrice du support est communément détruite ou dissoute et les cellules vivantes sont ensuite comptées. Pour des supports solides, cette méthode ne peut pas être utilisée car la destruction du support résulterait en un stress mécanique trop grand pour les cellules et, conséquemment, en un taux de mortalité des cellules élevé. Un autre moyen de quantifier la biomasse immobilisée est la mesure de la différence de poids du support avant et après colonisation. Cette technique est très souvent utilisée pour des supports solides (Gonçalves et al. 1992; Senthuran et al. 1997), mais elle a le désavantage de doser également les substances accumulées dans la matrice du support pendant la fermentation, comme, par exemple, les EPS. De plus, cette méthode donne seulement une information sur la biomasse totale, sans tenir compte de sa viabilité, et dose alors aussi la biomasse morte. Comme l'immobilisation cellulaire résulte souvent en un changement majeur de la taille des cellules immobilisées (voir chapitre 1.3.4), avec des cellules immobilisées généralement plus petites que leur contre-parties planctoniques, la valeur de biomasse des cellules immobilisées ne peut pas estimer précisément le nombre de cellules vivantes, en utilisant une courbe de calibration déterminée avec des cultures planctoniques.
La spectroscopie diélectrique et la résonance magnétique nucléaire sont deux méthodes non-destructives pouvant servir à doser des cellules microbiennes immobilisées, déjà mentionnées et discutées auparavant. Ces méthodes permettent de suivre la biomasse en ligne. La spectroscopie diélectrique se base sur la mesure de la capacitance qui est une fonction de la concentration des cellules microbiennes dans un champs électrique. Elle est surtout appliquée dans la fabrication de la bière pour le contrôle de biomasse de la levure (Austin et al. 1994). Un avantage de cette méthode est qu’elle n’est pas influencée par la présence de solides dans le champs électrique, ce qui la rend particulièrement intéressante pour des systèmes avec des cellules immobilisées. Cependant, il y a des difficultés à utiliser cette méthode pour la mesure de la concentration en bactéries, car sa sensibilité est directement proportionnelle à la grandeur (le volume) des cellules. Mishima et al. (1991) ont ainsi mesuré, entre autres, la concentration de Saccharomyces cerevisiae, incluse dans des billes de calcium alginate, et de cellules libres de Escherichia coli.
Un autre moyen de quantifier les cellules immobilisées est le dosage d'un de leurs composants. Ce composant doit être spécifique pour des microorganismes et ne pas se trouver dans le support non-colonisé, comme les protéines (Moreira et al. 1978; Robinson et Wang 1987), l'adénosine triphosphate (ATP) (Gikas et Livingston 1993; 1998) et l'acide désoxyribonucléique (ADN) (Buchtmann et al. 1997; Raebel et Schlierf 1980; Wang 1988; Wang et Wang 1989). Si la quantité d'un composant par unité de biomasse ou par cellule est connue, le contenu de ce composant dans un support peut être mesuré et corrélé avec le contenu en cellules immobilisées. Cette approche a été testée pour les protéines, l'ATP et l'ADN et les résultats sont discutés au Chapitre 3.
L'immobilisation cellulaire résulte pour les bactéries immobilisées en des conditions environnantes différentes de celles des cellules planctoniques. Une limitation du transfert de masse crée un micro-environnement autour des cellules affectant la diffusion de nutriments vers la cellule mais aussi l'élimination des produits comme l'acide lactique (Champagne et al. 1994). Les propriétés du support, les conditions hydrodynamiques dans le fermenteur, mais aussi la production et l’excrétion de substances extracellulaires, en particulier des EPS, sont des facteurs qui affectent la résistance à la diffusion (Karel et al. 1985). L'accumulation des produits métaboliques peut diminuer le taux de croissance et changer la physiologie et la morphologie des bactéries lactiques immobilisées (Cachon et al. 1998; Champagne et al. 1994; Krishnan et al. 2001).
Karel et al. (1985) ont déjà constaté que la voie métabolique des cellules attachées à des surfaces peut être différente de celle des cellules libres. Des travaux plus récents ont démontré l'existence de mécanismes de reconnaissance de surface pour les bactéries (Prigent-Combaret et al. 1999; Wen et Burne 2002) et des changements physiologiques dus à la présence de surfaces (O'Toole et al. 2000a; 2000b; Parsek et Greenberg 2000; Rashid et al. 2000). Entre-temps, plusieurs travaux ont rapporté de tels changements lors des fermentations avec des cellules immobilisées, notamment une tolérance accrue envers l'inhibition par le produit (Fortin et Vuillemard 1989; Krisch et Szajani 1997; Teixeira de Mattos et al. 1994) ou même envers d'autres facteurs de stress environnementaux (Doleyres et al. 2002a; Jouenne et al. 1994; Keweloh et al. 1989; Keweloh et al. 1990; Trauth et al. 2001).
Depuis une dizaine d’années, le consommateur a développé son intérêt pour des aliments naturels, sans additifs et de haute qualité. À cause d’une prise de conscience pour une alimentation équilibrée, des produits avec un taux de matière grasse moins élevé sont préférés. De plus en plus, des produits avec une allégation santé et des denrées fonctionnelles percent sur le marché. Ces dernières années, l’industrie laitière a commencé à utiliser des bactéries lactiques produisant des exopolysaccharides parce qu’elles améliorent les caractéristiques rhéologiques des laits fermentés, ce qui permet d'éviter l’utilisation des additifs épaississants, de réduire la matière grasse dans les produits et même la teneur en solides du lait pour une même fermeté ou viscosité du produit.
La faible production des exopolysaccharides par les bactéries lactiques et l’instabilité du phénotype mucoïde est un problème reconnu et la raison pour laquelle, jusqu'à maintenant, ces EPS sont exclusivement produit in situ dans des produits comme le yogourt ou les laits fermentés. L’incorporation d'un agent fonctionnel issu des bactéries lactiques permettrait de standardiser le produit, mais l'exploitation d’une fermentation pour produire des exopolysaccharides comme bioingrédients fonctionnels sera fortement dépendante du rendement du procédé. L’immobilisation de la souche est un moyen efficace d'augmenter la productivité et de stabiliser biologiquement des fermentations en continu. Parce que les propriétés mucoïdes des souches productrices d'EPS favoriseraient fortement l’immobilisation par adhésion dans des supports poreux, c'est cette dernière qui est étudiée dans cette thèse.
Le nouveau bioingrédient fonctionnel devra faire face à la concurrence de polysaccharides d'autres origines comme le xanthane et la gomme de caroube. Afin de rendre les EPS des bactéries lactiques concurrentiels, il est important de trouver les conditions optimales (température, pH, taux de dilution) des fermentations en continu avec des cellules immobilisées pour la production d'EPS. Pour l'optimisation des fermentations, plusieurs échantillons doivent être pris et la quantité d'EPS doit être déterminée. Cependant, les méthodes existantes pour l’isolement et la purification des EPS sont de longue durée, et nécessitent un volume important d'échantillon. Ceci rend la détermination de la quantité et de la qualité des EPS laborieuse et difficile. Le développement d'une nouvelle méthode fiable, simple et nécessitant un faible volume d'échantillon pour le dosage des EPS est alors nécessaire.
Le substrat de la fermentation choisi est à base de perméat de lactosérum, un sous-produit de l’industrie laitière, contenant la quasi totalité du lactose du lait. Si le perméat de lactosérum n'est pas traité, il présente une source importante de pollution de l'industrie fromagère. Il est disponible en grande quantité et de valorisation limitée mais est une excellente source de carbone et de minéraux pour des fermentations avec des bactéries lactiques.
La souche Lactobacillus rhamnosus RW-9595M a été choisie comme souche de travail à cause de ses propriétés technologiques (viscosité, arômes), nutritionnelles (fibre alimentaire, probiotique) et éventuellement nutraceutiques associées à une forte synthèse d'EPS. Cette souche a démontré une forte production d'EPS de 2775 mg/l dans un milieu à base de perméat de lactosérum (Macedo et al. 2002b).
Jusqu'à maintenant, aucune étude à été réalisée sur la production d'un hétéropolysaccharide par des bactéries lactiques immobilisées. L'hypothèse que l'immobilisation cellulaire permettra d'augmenter la productivité en EPS lors des fermentations en batch et en continu conduit directement à la formulation de l'objectif général de ce travail.
L’objectif général de ce travail est de développer et d’optimiser une technologie de production d'exopolysaccharides, basée sur la fermentation avec des cellules immobilisées, d’un milieu à base de perméat de lactosérum (PLS).
Les objectifs spécifiques sont :
Développer une méthode précise et rapide de mesure des EPS produits dans le milieu de fermentation.
Évaluer l’aptitude de plusieurs supports, compatibles avec une utilisation alimentaire, pour l’immobilisation par adhésion de Lactobacillus rhamnosus RW-9595M.
Développer une méthode précise de dosage des cellules immobilisées dans des supports solides poreux.
Exécuter et caractériser des fermentations avec des cellules planctoniques en batch et en continu pour la production de biomasse, de produits métaboliques et d'EPS dans le PLS.
Exécuter et caractériser des fermentations en batch répété et en continu avec des cellules immobilisées dans le PLS et comparer la production d'EPS avec les fermentations avec des cellules planctoniques. Lors des fermentations en continu, nous avons étudié particulièrement l’effet du taux de dilution, de la température et de la concentration en extrait de levure en rapport avec la cinétique des fermentations et la productivité en EPS.
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| Introduction générale |  | Chapitre 2 New method for exopolysaccharide determination in culture broth using stirred ultrafiltration cells |
